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       【摘要】 
       目的观察不同浓度大黄素对泼尼松致大鼠脂代谢异常的预防作用。方法3月龄大鼠给予泼尼松和药物90 d。观察血清生化指标、器官指数和骨髓基质细胞体外的成脂能力。结果给予泼尼松和药物90 d后大鼠高密度脂蛋白胆固醇降低，骨髓基质细胞体外成脂能力增强。大黄素90 mg·kg- 1·d- 1和大黄素270 mg·kg- 1·d- 1可升高高密度脂蛋白胆固醇和骨髓基质细胞体外成脂能力。结论大黄素对泼尼松引起的脂代谢异常有预防作用。
       【关键词】  大黄素 糖皮质激素 血脂 骨髓基质细胞 大鼠
       Abstract:ObjectiveTo determine whether emodin can completely prevent dyslipidemia in rats treated with prednison. MethodsThirty-five Sprague-Dawley male rats at age of 3 months were divided into five groups and treated for 90 days as follows: intact rats were given with vehicle as control; Prednisone was given orally to the rats at dose of 3.0 mg/kg/d as the model group; Emodin at dose of 90mg/kg/d or 270 mg/kg/d were plus to the prednison treated rats and Integrated medicine (Calcium 375 mg/kg/d+VitD3 250 U/kg/d ) were plus to the prednison treated rats. The blood serum was separated for testing biochemistry indices. the MSCs were isolated by density-gradient centrifugation and cultured.ResultsRats treated with GC decreased serum HDL-Cholesterol and significantly increased serum sulfur compared with vehicle controls. Treatment with emodin markedly increased in the serum HDL-Cholesterol level and decreased serum sulfur. Emodin prevented adipogenic differentiation of MSCs from prednisone-treated rats.ConclusionEmodin shows effect of prevention against Glucocorticoid -induced dyslipidemia in rats.
       Key words:Emodin;  Glucocorticoid;  Dyslipidemia;  Marrow stromal cells;  Rats
        糖皮质激素在临床上应用极为广泛，但长期大剂量使用可造成一系列严重的不良反应，脂代谢异常便是糖皮质激素长期应用的严重不良反应之一。脂代谢异常可以导致许多心血管疾病发生，如冠脉粥样硬化和中风等，同时也可能是糖皮质激素性骨质疏松的重要发病机制之一。大黄素(emodin)化学名为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌(1,3,8-trihydroxy-6- methylan-thraquinone)，属于羟基蒽醌类。有降血脂作用［1］；能抑制3T3 L1小鼠前脂肪细胞分化为脂肪细胞，以及抑制脂肪酸合成酶的活性［2］。本实验观察大黄素对长期用糖皮质激素大鼠的脂蛋白水平和骨髓基质细胞的成脂分化能力的影响，为阐明糖皮质激素对脂代谢的影响和大黄素对此的对抗作用提供进一步的实验依据。
       1  材料与方法
       1.1  材料DMEM（L）培养基购自Gibco公司；Percoll液购自amersham pharmacia公司；大黄素对照品由陕西省物资产业集团总公司提供；醋酸泼尼松（浙江仙琚制药股份有限公司，批号030605）；碳酸钙（广州化学试剂二厂，批号2002041201）；维生素D3（上海第九制药厂，批号020903，30万单位/ml）。高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒购自宁波市慈城生化试剂厂；总胆固醇测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司；碱性磷酸酶测定试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。
       1.2  仪器酶标仪（Bio-ELx-800型，美国）；电感偶合等离子体直读光谱仪（日本岛津公司）；752紫外光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；AE240电子天平（Mettler-Toledo instr.shanghai Ltd）。NAPCO二氧化碳恒温培养箱：5420-1， Precision Scientific USA；XD-101倒置相差显微镜，江南光电股份有限公司。
       1.3  动物及其分组3月龄雄性SD大鼠（广东医学院实验动物中心提供）35只，普通级；分笼饲养，饲养于室温23℃，相对湿度80%的清洁环境中，自由摄食和摄水；使用标准饲料，其中钙含量1.33%，磷含量0.95%。随机分成5组，1组（对照组，7只）；2组（模型组，7只）；3组（阳性对照组，7只）；4组（大黄素低剂量组，7只）；5组（大黄素高剂量组，7只）。1组每天上、下午灌胃给予含0.1%吐温80的生理盐水（溶剂对照）；，2组每天上午灌胃给予含0.1%吐温80的生理盐水，下午灌胃给予泼尼松3 mg/kg，其余3组每天下午以醋酸泼尼松3 mg·-1kg·d-1灌胃，上午给予下列药物：3组灌胃碳酸钙375 mg/kg +VitD3250 U/kg，4组灌胃大黄素90 mg/kg，5组灌胃大黄素270 mg/kg。所有动物给药时间为90 d。
       1.4  标本的制备和处理用戊巴比妥钠麻醉后心脏抽血处死，分离血清，用电感偶合等离子体直读光谱仪测定钙、磷、硫含量；分别采用连续监测法、磷钨酸-镁沉淀法、酶比色法(CHOD-PAP法)测定血清中碱性磷酸酶、高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇的含量。取出肝脏、胸腺、脾、左肾、左脑称湿重。
       1.5  大鼠骨髓基质细胞的制备及培养在1，2，3，5组动物中每组随机选取4只动物，分离股骨收集骨髓基质细胞。具体步骤：在无菌条件下分离大鼠股骨，切除股骨两端。用4°C的DMEM(L)培养液从股骨上端往下冲出骨髓，8根股骨冲出的骨髓收集于同一烧杯中，混匀吹散细胞，2 000 r/min离心10 min，弃上清。沉淀用DMEM(L)培养液充分混匀，制成细胞悬液，轻轻叠加到等体积的密度为1 073 g· L-1的4℃的Percoll分离液上，2 000 r/min离心30 min后收集界面层细胞，用不含血清的DMEM(L)培养液离心洗涤后重悬，吹打均匀后以4×105·cm-2密度接种，37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2孵箱静置培养。细胞融合后用0.25%胰酶消化传代。1.6  统计学处理计量资料以 表示。SPSS11.0软件行方差分析并行Bonferroni组间比较，双侧P<0.05为统计检验显著性标准。
       2  结果
       2.1  大黄素对糖皮质激素大鼠内脏指数的影响大鼠处死后取下各器官称其湿重，以器官湿重除以体重得器官重量指数。实验结果显示各组动物的内脏指数无明显变化。表1  大黄素对糖皮质激素大鼠内脏指数的影响g·(略)
       2.2  大黄素对糖皮质激素大鼠血清微量元素含量的影响给予泼尼松90 d后，大鼠血清中硫含量明显升高。大黄素对此有预防作用，高、低剂量组可使血硫降低（P<0.05），而复方钙组对此无预防作用，血硫含量与模型组相当。给予泼尼松90 d后，大鼠血清中钙、磷含量无明显变化。表2  大黄素对糖皮质激素大鼠血清微量元素含量的影响(略）
       2.3  大黄素对糖皮质激素大鼠血清生化指标的影响给予泼尼松90 d后，大鼠高密度脂蛋白胆固醇含量降低，碱性磷酸酶含量有下降的趋势。大黄素和复方钙均可升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL)含量和碱性磷酸酶含量，高密度脂蛋白胆固醇含量和碱性磷酸酶含量与对照组相当。
       表3  大黄素对糖皮质激素大鼠血清生化指标的影响(略）
       2.4  大鼠骨髓基质细胞自发成脂能力比较骨髓基质细胞传代后对照组和加药组梭形或三角形细胞较多，且细胞胞核较大，胞浆丰富。只看到小部分细胞自发分化为脂肪细胞，细胞内出现脂滴。激素组除了成纤维样细胞外，还有部分细胞变圆变大，细胞内出现密布的脂滴，细胞聚集处可见较多代谢产物堆积。见图1～4。图1～4为体内灌胃给予泼尼松和药物90 d后的各组大鼠的骨髓基质细胞传代培养时的细胞形态。
       3  讨论
       3.1  长期给予糖皮质激素可致大鼠脂代谢异常给予泼尼松90 d后，大鼠高密度脂蛋白胆固醇(HDL)含量降低。总胆固醇含量无明显变化提示实验动物血中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)等含量升高。HDL的生理作用是逆向转运胆固醇，抑制动物壁平滑肌细胞摄取LDL，从面防止胆固醇在细胞内过多堆积，具有抗动脉粥样硬化的功能。长期大量应用糖皮质激素使HDL下降， LDL升高，可增加心血管疾病危险。Miyanish等［3］报道LDL/HDL比值的升高增加家兔骨坏死的产生，提示血脂的异常改变可能是糖皮质激素性骨坏死的重要发病机制之一。
        体内给予泼尼松的激素组大鼠的骨髓基质细胞体外培养时自发分化为脂肪细胞的能力增强。骨髓基质细胞(Marrow Stromal Cells，MSCs)中存在的间质干细胞是一种具有自我更新、复制及多向分化潜能的成体干细胞。目前知道，骨髓基质细胞可向多个方向分化。骨髓基质细胞表面存在糖皮质激素受体，糖皮质激素是很强的促进MSCs脂肪分化的因子［4,5］， 糖皮质激素可通过核受体途径在转录水平调控脂肪分化。这是糖皮质激素导致骨质疏松和骨坏死的重要机制。Rodrignez等［6］证实骨质疏松组MSCs的成脂肪分化能力强于对照组。在类固醇造成的骨质疏松动物实验中，发现骨髓腔内脂肪细胞的数目也明显增加。Ogston等［7］报道了糖皮质激素治疗的猪基质血管细胞（s-v cells）发生前脂肪细胞分化。人体组织病理发现，GC可引起骨髓脂肪栓栓塞，局部缺血［8］。Miyanishi等［9］发现，GC处理的家兔，骨髓脂肪细胞体积增大，骨间隙压力增大，骨髓微循环减少，出现骨坏死现象。
       3.2  大黄素对糖皮质激素大鼠脂代谢异常的预防作用大黄素存在于何首乌、虎杖、决明子、大黄、芦荟等含蒽醌类成分的中药中，作用极其广泛，对全身多个系统都有影响。本实验观察到其对泼尼松引起的脂代谢紊乱有一定的对抗作用。有文献报道，大黄素对3T3 L1小鼠前脂肪细胞向脂肪细胞的分化以及对脂肪酸合成酶活性有剂量依赖性抑制作用［1～2］。大黄素的这种作用也有可能与其影响TGF和BMP的分泌有关［10］。现已知道，骨髓基质细胞和脂肪细胞上都有TGF-β相关因子的受体和BMP的受体。TGF和高浓度的BMP能延迟骨髓基质细胞向脂肪细胞分化。大黄素对IL-6因子的影响也有可能调节MSCs的成脂分化。IL-6，IL-6受体与gp130分子形成三聚体复合物，当两个三聚体复合物相连时，信号转导蛋白gp130二聚化，出现信号转导，减少脂滴的聚集和LPL活性。大黄素的抑制成脂分化的作用也可能与其雌激素样作用有关。雌激素可抑制MSCs分化为脂肪细胞，Okazaki研究［11］骨髓基质细胞系ST-2时发现，雌二醇能使脂肪细胞生成减少，且作用可被雌激素受体拮抗剂所拮抗。
        本实验选用碳酸钙和1,25-(OH)2 VitD3组成的复方作为阳性药物，体内给予碳酸钙和1,25-(OH)2D3后能升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL)含量和对抗糖皮质激素引起的骨髓基质细胞的成脂分化。已有体外实验证实1,25-(OH)2VitD3可抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化。Kelly等［12］将不同浓度的1,25-(OH)2VitD3分别作用于MSCs原代细胞及细胞株BMS2和BMS2的亚克隆，发现1,25-(OH)2VitD3主要阻断因糖皮质激素诱导的成脂分化。还可抑制培养大鼠MSCs中地塞米松诱导的脂肪形成和抑制MIH(一种鸡尾酒药物)诱导的BMS2细胞的脂肪分化，抑制糖皮质激素和胰岛素诱导的3T3-L1细胞脂肪形成，在小鼠乳腺源STl3细胞系及大鼠MSCs中也有类似作用［13］。
        糖皮质激素长期应用引起的脂代谢紊乱可导致多种心血管疾病和内分泌系统疾病，大黄素对脂代谢的调节作用提示其对糖皮质激素引起的部分不良反应可能有对抗作用。
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