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       【摘要】 
       目的探讨蟾酥对L615白血病的疗效及其可能机制，并对其临床应用提供参考。方法对小鼠行L615白血病造模。造模成功后，蟾酥溶液分别按低、中、高剂量进行腹腔注射给药，1次/d，连续10 d，观测小鼠体重变化，生存时间，外周血白细胞计数、分类及血小板计数，肝脾指数，肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类，流式细胞术测定细胞凋亡率。结果 L615模型组体重明显减轻，蟾酥低、中、高剂量组体重无明显变化；蟾酥低、中、高剂量组小鼠生存时间比L615模型组长，且中、高剂量具有显著差异（P<0.05或P<0.01）；外周血象，同组不同病程，白细胞、血小板计数与实验前比较有显著差异（P<0.05或P<0.01）,濒死期各组与L615模型组比较，白细胞、血小板计数，L615白血病细胞百分比有显著差异（P<0.05或P<0.01）；白血病死亡小鼠蟾酥各组脾脏指数均低于L615模型组，且有差异（P<0.05）；流式细胞术证实，蟾酥能诱导L615白血病细胞凋亡，凋亡率呈剂量依赖性。结论蟾酥对L615白血病具有一定的疗效，其机制之一是诱导白血病细胞凋亡，其次蟾酥能抑制L615白血病细胞对免疫系统的浸润。
       【关键词】  蟾酥 L615白血病模型 生存时间 细胞凋亡 流式细胞术
       Abstract:ObjectiveTo study the therapeutic effects and the potential mechanism of Chansu on the L615 leukemia and provide some advice to its clinical practice. MethodsAfter the model was estabished successfully, Chansu solution (respectively by the low, middle, high dose once a day) was injected intraperitoneally for 10 days continually, the body weight, survival time, peripheral blood leukocyte count and classification, platelet count, hepatosplenic index, hepatic and splenic and bone marrow smears, bone marrow leukocyte classification were observed and the apoptosis rates were determined by FCM. ResultsThe weight in L615 group decreased obviously and the groups injected with Chansu had few changes; the survival time of Chansu groups were longer than those of L615 group, and there were significant differences between middle and high dose Chansu groups(P<0.05 or P<0.01); peripheral hemogram, different illness time within the same group, leukocyte count and platelet count changed a lot after the experiment ( P<0.05 or P<0.01); during the dying period, compared with the L615 group, the leukocyte and platelet count and the L615 leukemia cell percentage had differences ( P<0.05 or P<0.01);significant differences was observed  between the splenic index of death leukemia mice and those in L615 group (P<0.05); the FCM proved that Chansu could induce the apoptosis of L615 leukemia cells in dose-dependent manner. ConclusionChansu has some therapeutic effects to the L615 leukemia. To induce apoptosis is one of its mechanisms. Also, Chansu can inhibit the infiltration of leukemia cells to immune system.
       Key words:Chansu；  L615 leukemia mould；  Survival time；  Apoptosis；  FCM
        以往的实验结果表明，蟾酥对淋巴细胞白血病CEM细胞具有较强的抑制作用，诱导CEM细胞调亡是其机制之一［1］。本研究进行体内实验，利用蟾酥溶液作用于可移植性小鼠淋巴细胞白血病-L615白血病，观察其疗效。现报道如下。
       1  材料和方法
       1.1  药品 
       蟾酥购于山东临沂爱康药业有限公司，按文献［1］配成浓度为10 mg/ml的蟾酥溶液，滤过除菌，然后再配成0.05，0.1 mg/ml和0.3 mg/ml 3种溶度备用。
       1.2  细胞培养 
       L615白血病细胞株购于中国医学科学院血液研究所（天津）。培养基为含体积分数10%的小牛血清（杭州四季青）的RPMI-1640（Gibco公司产品），并加入双抗（青霉素100 μg/ml和链霉素100 μg/ml）。在37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱（Therno Forma公司产品）中培养，取对数生长期细胞进行造模。
       1．3   模型的建立 
       取对数生长期L615白血病细胞（L615细胞），离心1 500 r/min，8 min，去上清液，用生理盐水洗涤2次，调整细胞终浓度为1.4×106/ml。取615近交系小鼠（购自中国医学科学院血液学研究所）16只，鼠龄8～10周，体重24～27 g，雌雄各半。无菌操作，每只小鼠腹腔注射接种L615细胞7×105个，造成L615白血病模型（全身白血病）［2］。小鼠在层流架内饲养，一切与鼠接触的物品均按无菌要求处理。
       1.4  分组及给药方法 
       将L615白血病模型小鼠随机分为4组。每组雌雄各半，即L615模型组（对照组）(模型组，每次给生理盐水0.4 ml) ；蟾酥Ⅰ组（低剂量组，每次按0.6 mg/kg给药），蟾酥Ⅱ组（中剂量组，每次按1.8 mg/kg给药），蟾酥Ⅲ组（高剂量组，每次按5.4 mg/kg给药）。模型建立后，第2天开始按以上方案腹腔注射给药，1次/d，连续10 d。
       1.5  观测指标
       ①体重变化；②生存时间，用公式（T-C）/C×100%计算其生命延长率（T、C分别为试验组、对照组平均生存天数）；③外周血白细胞（WBC）计数及分类，血小板（PLT）计数；④肝脾指数；⑤肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类。
       1．6   流式细胞术（FCM）分析
        
       取濒死期各组小鼠外周血，每个样本0.5ml入已加淋巴细胞分离液的试管内，离心1 500 r/min，20min，然后小心吸出白色层（白细胞层），进行细胞计数（每个样本细胞数应大于1×106），用PBS洗涤，然后按凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司产品）要求进行操作。上机检测（流式仪为BECTON DICKNSON,B、D公司产品），采用CenQuest软件获取10 000个细胞，ModFitlt软件分析并获得结果。
       1.7  统计学处理 
       采用双侧t检验，P<0.05认为差异有显著性。
       2  结果
       2.1   体重变化
       蟾酥Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组给药前，给药后第5天及濒死期小鼠体重无明显改变，但对照组濒死期与给药前比较，体重有所减轻，且具有显著性差异（P<0.05）。结果见表1。表1  各组小鼠体重的变化比较 (略)
       2.2  生存时间 
       蟾酥Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组与对照组比较，生存时间均有不同程度的延长，蟾酥Ⅱ，Ⅲ组比较差异具有显著意义，各组小鼠生存时间及生命延长率结果见表2。表2   各组小鼠生存时间比较(略)
       2.3  外周血象 
       L615白血病鼠分组给药后，同组间比较白细胞数均逐渐上升，至第5天蟾酥Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组有统计学意义。濒死小鼠白细胞均显著增高（P<0.01）。血小板是先升后降，至濒死期，各组血小板数已极度降低（P<0.01）。在给药后第5天外周血未发现L615细胞，但进入濒死期对照组L615细胞已占50.25%，蟾酥Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组L615细胞不及对照组高，并具有显著性差异（P<0.05,P<0.01）。结果见表3。表3  各组小鼠外周血WBC，PLT计数及L615细胞百分比比较(略)
       2.4  肝脾指数 
       各组死亡小鼠的肝脏指数无差异，脾脏指数蟾酥组较对照组低，组间比较有统计学意义（P<0.05）。结果见表4。表4  各组肝脾指数比较(略)
       2.5  肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类 
       对照组及蟾酥各组小鼠死亡后，取其肝、脾、骨髓进行涂片（解剖时见胸腹部皮下有出血点且对照组出血点更广泛而密集，甚至出现淤斑），瑞氏染色。油镜下可见，各组肝、脾、骨髓内绝大部分为L615细胞，且生长旺盛，尤其是肝脏内L615细胞比在体外培养时体积大，形状不规则。总体印象：胞浆少，嗜碱性，核浆比例严重失调，胞核体积远远大于胞浆；核染色质粗，核仁1～数个（图1）。骨髓白细胞分类见表5。蟾酥Ⅲ组L615细胞百分比比对照组显著减少（P<0.05）。表5  各组骨髓WBC及L615细胞百分比比较(略)
       
       2.6   流式细胞仪测定白细胞凋亡率 
       根据FCM检测结果可知（图2），蟾酥诱导L615白血病小鼠白细胞凋亡，随药物浓度的增加凋亡率也增加（图2中右上象限为晚期凋亡百分率，右下象限为早期凋亡百分率，两者之和为凋亡细胞百分率）。结果见表6。表6  各组白细胞凋亡率比较（略）
       3  讨论
        本实验结果显示：蟾酥作用于L615白血病小鼠后，能显著延长小鼠生命，且随药物浓度增加，而生命延长率也增加，实验前后，蟾酥组小鼠体重变化不大。而L615模型组体重明显减轻。外周血象濒死期比较白细胞数，蟾酥组远低于对照组；各组在病程早、中期血小板数量逐渐升高，进入白血病晚期随之下降，对照组下降更为显著，这与解剖所见对照组皮下出血点更明显相一致。这可能是蟾酥对骨髓的异常造血功能具有抑制作用，而对凝血功能影响较小。L615细胞在外周血白细胞中所占比例对照组远高于蟾酥各组。这些变化皆说明对照组小鼠的病情比蟾酥组更严重，从脾脏指数的变化显示对照组脾脏受到了L615细胞的严重浸润，同时说明蟾酥对L615细胞侵犯免疫系统具有一定的抑制作用。流式细胞术证实，蟾酥能诱导小鼠体内白血病细胞的凋亡。以上实验数据表明，蟾酥对L615白血病具有一定的疗效，其机制之一是诱导白细胞凋亡，再则对机体免疫系统功能的保护有一定的作用。
        目前白血病治疗主要采用药物、化疗和骨髓移植等3个方面。药物治疗白血病效果不甚理想，副作用多，甚至出现骨髓抑制现象，化疗虽有杀灭白血病细胞解除白血病细胞的浸润作用，但同时对正常细胞也有损伤，骨髓移植成功率不高，且费用贵。根据白血病的临床特点，在中医学中属于“急劳”“热劳”“虚劳”“血症”的范畴［3］。白血病属顽疾，古代医家认为对顽病痼疾当“以毒攻毒”，蟾酥为有毒中药，以蟾酥治疗白血病符合“以毒攻毒”原则。蟾蜍治愈淋巴细胞白血病就是个例子［4］。从蟾酥抗实体肿瘤显示，它在抗肿瘤的同时还具有恢复细胞免疫功能及提升白细胞作用［5］。这与我们的实验结果相一致，为蟾酥走向临床，应用于白血病的治疗提供了一定的理论依据。当前抗白血病药物存在骨髓抑制现象，与之相比蟾酥具有其优越性。
       【参考文献】
         　　［1］朱大诚，尹小明，黄学明，等. 蟾酥对白血病CEM细胞的抑制作用及诱导其凋亡的研究［J］.时珍国医国药，2007，18（10）：2398.
       
       ［2］储建新，李肇玫．615近交系小鼠及其在实验肿瘤研究中的应用［M］.北京：人民卫生出版社，1989：112．
       
       ［3］邓成珊，周蔼祥． 当代中西医结合血液学［M］.北京：中国医药科技出版社，1997：136.
       
       ［4］尹小明，朱大诚．蟾蜍治疗白血病成活31年1例［J］.实用中西医结合临床，2005，5（1）：41．
       
       ［5］程国华．蟾酥质量研究及其药理临床应用进展［J］.中草药，2001，32（2）：184．