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       【摘要】 
       目的研究牛蒡子合剂不同提取部位对糖尿病大鼠尿白蛋白和胰岛素抵抗的影响。方法采用高糖高脂饲料喂养配合链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠糖尿病模型，经牛蒡子合剂不同提取部位灌胃治疗8周后，观察大鼠尿微量白蛋白、尿蛋白、血糖指数的变化。结果牛蒡子合剂正丁醇提取部位灌胃治疗后，糖尿病大鼠的尿微量白蛋白、尿蛋白、血糖指数均有一定的改善。结论 牛蒡子合剂正丁醇提取部位具有较好的减轻糖尿病大鼠尿白蛋白和胰岛素抵抗的作用。
       【关键词】  糖尿病大鼠 牛蒡子合剂 白蛋白 胰岛素抵抗
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of the different extracts of Fructus Arctii Composition on urinary albumin and insulin resistance of diabetes mellitus rats.MethodsThe model of Diabetes Mellitus was STZ and high glucose-lipid diet, then treated with different extracts of Fructus Arctii Composition for 8 weeks, the changes of urinary albumin, urine protein and insulin resistance were observed.ResultsThe n-butanol extract of Fructus Arctii composition could improve the urinary albumin, urine protein and insulin resistance of  DM rats .ConclusionThe n-butanol extract of Fructus Arctii composition is good to lessen the urinary albumin and insulin resistance of DM rats.
       Key words：D.M. rats；  Fructus Arctii Composition；  Urinary albumin；  Insulin resistance
        
       牛蒡子合剂是博士导师陈以平教授在长期的临床实践中总结出的治疗糖尿病肾病的中药复方中的最重要的两种成分，已进行了动物实验研究和初步临床实验明确牛蒡子合剂的醇提物具有最佳的药效［1～6］。为了进一步明确其物质基础，我们在上海市科委的资助下，进行了牛蒡子合剂不同提取部位对糖尿病大鼠尿白蛋白和胰岛素抵抗的影响的研究。
       1  材料
       1.1  动物采用清洁级三月龄雄性Wistar大鼠，购于上海动物实验中心，饲养于上海中医药大学实验动物中心清洁级动物室，体重在180～200 g之间。
       1.2  药物牛蒡子（批号031105）、黄芪（批号031201）购自上海徐汇中药饮片厂。
       
       牛蒡子合剂不同极性部位的提取：
       
       30 kg牛蒡子和30 kg黄芪药材粉碎成粗粉，95%乙醇渗漉提取，收集渗漉液，回收乙醇，稠浸膏加等量的水混匀，加入石油醚萃取3次，合并石油醚层，回收石油醚，得到石油醚提取物（726 g）；母液中加入氯仿萃取3次，合并氯仿层，回收氯仿，得到氯仿提取物（2065 g）；母液中加入水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，回收正丁醇，得到正丁醇提取物270 g。
        科素亚（杭州默沙东制药公司，50 mg片剂，批号p1038）；文迪雅（天津葛兰素史克制药公司，4 mg片剂，批号04030014）；链脲佐菌素，sigma公司提供（批号053k1569）。
       1.3  仪器
       One Touch Ⅱ型血糖仪及其试纸：Lifescan公司。HITACH（日立）7170型自动生化分析仪。光学显微镜及摄像系统：Nicon公司。
       2  方法
       2.1   动物饲养与模型建立大鼠饲养于本校实验动物中心清洁级动物室。大鼠随机分为造模组110只，正常组8只。大鼠适应性喂养1周后，造模组给予特制高糖高脂饲料，饲料配制比例如下［7］：蔗糖20%，猪油10%，胆固醇 2.5%常规饲料 67.5%。正常组大鼠喂饲常规饲料，自由饮水与饲料。造模组高糖高脂饲料喂饲1个月后，继续药物造模。大鼠禁食12 h，链脲佐菌素（STZ）临用前用0.1 mol/L，pH 4.0的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度，以30 mg/kg的剂量，腹腔注射。72 h后检测空腹血糖和尿糖水平，以血糖>7.7 mmol/L且尿糖检测在+++～++++以上作为模型入选。正常组仅予以等量的枸橼酸缓冲液腹腔注射。
       2.2  分组给药确定造模大鼠达到模型标准后，稳定3 d后开始灌胃用药。
       2.2.1  A组、B组每只鼠每日分别予牛蒡子合剂正丁醇提取物2ml（相当于生药10.8 g/kg）和1 ml（相当于生药5.4g/kg）灌胃。
       2.2.2  C组、D组每只鼠每日予牛蒡子合剂氯仿提取物2 ml药液（相当于生药10.8 g/kg）和1ml药液（相当于生药5.4 g/kg）灌胃。
       2.2.3  E组、F组每只鼠每日予牛蒡子合剂石油醚提取物2ml药液（相当于生药10.8g/kg）和1ml药液（相当生药5.4g/kg）灌胃。
       2.2.4  G组、H组每只鼠每日予科素亚药液（30 mg/kg）和文迪雅药液（3 mg/kg）灌胃；
       2.2.5  模型组、正常组每只鼠予2 ml自来水灌胃。
       2.3  观测指标每天观察各笼大鼠的饮水量，每周统计各笼大鼠的进食量，每周称量大鼠的体重变化。 用药8周后用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，离心，计尿量，每个样本取5ml保存于－20℃冰箱中。检测尿蛋白、尿白蛋白。第8周末以戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血约6 ml，分别用于血肌酐、尿素氮、血清胰岛素及血糖等生化指标检测。
       2.4  统计分析
       数据统计均用SPSS10.0完成，其中各组均数以±s表示，资料统计采用One-Way ANOVA法分析，方差不齐时采用DunnettT3法分析。统计显著性水平为P<0.05。 
       3  结果
       3.1  一般情况正常组大鼠精神状况良好，动作自如，反应灵敏，皮毛有光泽。高脂高糖饲料喂养大鼠1个月后体重增长明显，摄食量多。在注射STZ4周后，摄食量较正常组明显增多，但体重增加不明显。模型组大鼠体重较注射前减轻，多饮多尿，精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓。中药各治疗组精神状况均较模型组良好，动作自如，反应灵敏度较正常组稍差。
        造模组及各用药组大鼠进食量、饮水量均较正常组显著升高；各用药组进食量、饮水量均较模型组低。
       3.2  第8周末空腹血糖（FPG）、空腹血清胰岛素（FINS）、胰岛素敏感指数（IAI）的变化见表1。表1  第8周末空腹血糖（FPG）、血胰岛素（FINS）、胰岛素敏感指数（IAI）的变化（略）
       空腹血糖：模型组及各中药治疗组、西药对照组较正常组高(P<0.05)。各组用药组之间无显著性差异（P>0.05）。各用药组血糖水平与模型组无显著性差异(P>0.05)。
        血清胰岛素（FINS）：各糖尿病大鼠（模型组及各中西药治疗组）FINS均比正常组高，有明显差异(P<0.05)；结合同时出现的高血糖，提示有胰岛素抵抗存在。
        各中药治疗组中，正丁醇大、小剂量组血清胰岛素较低。其它各中药治疗组与正丁醇大剂量组相比有明显差异(P<0.05)。正丁醇大剂量组FINS明显低于西药对照文迪雅组、科素亚组，有明显差异(P<0.05)。与模型组相比，FINS明显降低，有明显差异(P<0.05)。
        胰岛素敏感性指数(ISI)：是按照空腹血糖和空腹胰岛素乘积的倒数，ISI=1/FINS×FPG，因其为非正态分布，故分析时采用其自然对数来获得，即IAI=Ln1/FINS×FPG［8］。
        正丁醇大剂量组和胰岛素增敏剂文迪雅组均出现胰岛素敏感性指数(ISI)升高的趋势，与正常组相比，无明显差异；较模型组敏感性指数增加，有显著差异(P<0.05)。与其它各中西药治疗组比较也明显增高，有显著差异(P<0.05)。
       3.3  第8周末尿白蛋白（Alb）和24 h尿蛋白定量的变化见表2。表2  第8周末尿白蛋白、24 h尿蛋白的变化（略）
        尿微量白蛋白(UAlb)：模型组与各治疗组均明显高于正常组（P<0.05）。各治疗组中，正丁醇大剂量组尿微量白蛋白最低，与其它各治疗组、西药对照组及模型组相比，有显著差异（P<0.05）。
       4  讨论
        牛蒡子合剂由黄芪和牛蒡子两味药物组成。黄芪味甘性温，功在益气健脾，利水消肿；牛蒡子味苦性寒，有宣肺利水、清热解毒之效，两药合用，一阴一阳，一补一清，一温一寒，甘温益气，甘寒养阴，共奏益气养阴，清热解毒，利水消肿之效。通过本次动物实验研究，我们发现牛蒡子合剂正丁醇大剂量组在改善糖尿病大鼠的血胰岛素水平、血糖指数、24 h尿蛋白和微量白蛋白方面均优于其他中药治疗组。分析改善糖尿病肾损害的作用机理可能与以下因素有关：
       4.1  改善胰岛素抵抗（IR）糖尿病作为代谢综合征的一部分,发病机制十分复杂,现在认为主要与IR及β细胞胰岛素分泌缺陷有关。胰岛素是血糖正常的平衡调节的关键因素,胰岛素刺激靶组织摄取、处理葡萄糖是进食后血糖平衡的重要机制;而夜间及空腹血糖平衡调节则以肝糖的产生及输出为主。
        当β细胞不足以完全代偿IR就出现血糖水平异常升高,病情加重,进入糖耐量异常期。刺激骨骼肌葡萄糖摄取所需要的胰岛素比抑制肝糖产生和输出所需的胰岛素多,因此最早出现餐后血糖水平增高,随后出现空腹血糖升高。当IR进一步加重,β细胞因长期代偿过度而衰竭,糖代谢进一步恶化,血糖升高达到糖尿病的诊断标准时,则为糖尿病临床期［9］。
       
       胰岛素敏感性可被看作是胰岛素介导的葡萄糖稳态的效率,高胰岛素正糖钳夹技术测定的葡萄糖代谢率是普遍接受的测定标准［10］。但是,流行病学研究需要一个简便经济的指标。很清楚,同时出现高胰岛素血症和高血糖就表明着有胰岛素抵抗(IR)。
        涉及空腹血糖（FPG）、空腹血清胰岛素（Fins）乘积的胰岛素敏感指数,如Matthews 等提出的HOMA-IR［11］(1985年的FIns/22.5e-logFPG或1995年的FPG ×FIns/22.5),1993年李光伟等［12］提出的1/FPG×FIns和2000年Katz等提出的QUICKI ［1/(logFPG+logFIns)］确实在很大程度上反应了机体的胰岛素敏感性,所以它们可以做为胰岛素敏感指数在流行病学研究中观察IR与其他因素的关联。
        本研究结果表明：糖尿病大鼠模型同时出现高血清胰岛素和高血糖，提示有胰岛素抵抗存在。
        各中药治疗组中，正丁醇大剂量组FINS明显低于西药对照组（文迪雅、科素亚组），有显著差异(P<0.05)。与模型组相比，FINS也有明显降低，有显著差异(P<0.05)。综合上述实验结果，正丁醇大剂量组在改善胰岛素敏感性方面，作用明显，于目前疗效肯定的胰岛素增敏剂文迪雅相比，作用相似。
       4.2   降低尿白蛋白及24 h尿蛋白有研究表明，DN存在肾小球高灌注，跨毛细血管的压力增加，可使系膜细胞及基质的生成增加。系膜细胞有平滑肌细胞特点，在压力增高时，其数目及大小均增加，而高灌注时肾小球基膜IV型胶原的mRNA含量增加，使肾小球毛细血管GBM增厚，最终还可导致系膜的弥漫、结节样病变，从而发生DN。
        IR影响尿微量白蛋白的原因尚不十分清楚,可能与以下因素有关［13］:在IR状态下,高胰岛素血症和胰岛素介导的扩张血管作用减弱致血管舒缩功能失调,肾小球出球小动脉过度收缩,导致肾小球血流量增加,肾小球毛细管静水压升高,处于高灌注状态,使尿白蛋白排出增多;高胰岛素血症还可选择性增加肾小球滤过膜的通透性,使白蛋白滤过增多;胰岛素降低肾近曲小管对白蛋白重吸收的饱和阈值,使白蛋白重吸收减少,尿白蛋白排出增多。本次实验结果显示，各治疗组中，正丁醇大剂量组尿微量白蛋白和尿蛋白最低，与其它各治疗组及西药对照组相比，有显著差异。说明它可能通过减轻DN大鼠肾脏的高滤过、高灌注，从而保护肾功能。
        综合本课题的实验结果，牛蒡子合剂正丁醇提取部位有较明显的改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗和尿微量白蛋白及尿蛋白的作用，较牛蒡子合剂其他提取部位有较明显的优势。
       【参考文献】
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