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       【摘要】 
       目的探讨夏枯草多糖抗单纯性疱疹病毒（HSV）及相关的免疫作用。方法通过96孔板病毒中和实验，观察细胞致病作用（CPE），体外研究夏枯草多糖的抗病毒作用，同时通过淋巴细胞转化增殖及细胞因子（IFN-γ）诱生实验研究夏枯草多糖的免疫活性。结果夏枯草多糖各部位（20mg/ml）分别在24，48 h内可减轻CPE，直接杀灭病毒作用较弱；免疫学试验表明体外均能明显促进淋巴细胞转化增殖，且有明显的剂量依赖性，并均能明显诱生IFN-γ。结论夏枯草多糖用于单纯性疱疹的治疗作用，可能不是由对病毒的直接作用引起的，而是促进淋巴细胞转化增殖和诱生干扰素等免疫调节作用的结果。
       【关键词】  夏枯草 多糖 单纯性疱疹病毒 免疫活性
       Abstract:ObjectiveTo study the anti- herpesvirus (HSV) and related immunocompetence of polysaccharides of Prunella vulgaris L.(XKCst).MethodsThe antivirus effect of XKCs was evaluated by cytopathic effect （CPE）in vitro through virus neutralization test and the immune activity of XKCs was studied through lymphocyte transformation test（LTT） and cytokine(IFN-γ)  induction test. ResultsThe various active fractions of XKCs (20mg/ml) might reduce CPE in 24 or 48 h, indicating their direct effect on virus was weak, however the immune experiments indicated that it could induce IFN-γ obviously and promote the lymphocyte transformation and propagation remarkably with obvious dosage dependence as well.ConclusionThe therapeutical effect of XKCs on herpesvirus might be the results of the immunity control actions,such as the promotion of the lymphocyte transformation and propagation and the inductiong of IFN-γ , rather than the direct action on virus.
       Key words:Prunella vulgaris L.;  Polysaccharides;  Herpesvirus (HSV);  Immunocompetence
        单纯性疱疹病毒(herpesvirus ，HSV)感染引起的生殖器疱疹（GH）往往较难治愈且经常复发，给患者带来了巨大的身心痛苦。目前，化学药物的治疗仍需配合免疫增强剂方可达到较好的治疗效果，而中药因兼具抗病毒和提高免疫等作用而日益被重视。
        《中国药典》收载品种夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L．的干燥果穗，有清火、明目、散结、消肿的功效［1］。已往对夏枯草的研究往往集中于小分子的药理活性研究，对多糖的生物活性研究很少［2］，我们已从夏枯草中分离出水溶性多糖组分（粗多糖经DEAE-Sepharose F.F.柱、透析袋透析纯化，得到了多个多糖组分），并对各多糖组分进行了体外抗单纯性疱疹病毒（HSV）以及与抗病毒相关的免疫活性研究。本文对分离得到的夏枯草各多糖组分抗HSV及相关生物活性进行报道。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  药物夏枯草粗多糖：夏枯草药材加水煎煮提取两次（20倍水/次，1 h/次），经85％乙醇醇沉，离心分离沉淀，沉淀真空干燥，即得粗多糖，以下简称XKC-C；夏枯草各多糖组分：XKC-C蒸馏水完全溶解（1 g生药/ml），透析，高速离心（15 000 r/min），上清液经DEAE Sepharose F.F凝胶柱，依次用水及0.2， 0.5，1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，分别分离得多糖部位XKC00，XKC02，XKC05，XKC10。其中XKC00为均一分子量多糖（26 kDa），XKC02经进一步透析，可分得两个均一分子量多糖XKC02-A（130 kDa） ，XKC02-B（5 600 Da），XKC05，XKC10均达到有效部位标准。
       1.1.2  细胞与动物非洲绿猴肾细胞(Vero cell line)购自华西医科大学；HSV-1、HSV-2购自中国科学院武汉病毒研究所，本实验室在Vero细胞上繁殖，常规传代后液氮保存。Balb/c小鼠，6～8周龄，18～22 g。
       1.1.3  试剂细胞培养基质RPMI-1640（GIBCO，美国）；胰酶（DIFCO，进口分装）；小牛血清（华西生化制品厂）；琼脂糖（浙江省洞头县水产公司海生物化工厂）； 3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）（中国科学院上海原子核研究所）；刀豆蛋白A（ConA）（Sigma）；IFN-γELISA试剂盒(美国) ； 49型玻璃纤维滤纸（上海虹光造纸厂）；96孔板（Nunc）。
       1.1.4  仪器NAPCO-5410型二氧化碳培养箱（美国）；β液体闪烁仪(LS9800型，美国Beckman)；Sunrise酶标仪（TECAN，西班牙）。
       1.2  方法
       1.2.1  样品细胞毒性将样品配制成20 mg/ml溶液，并对倍梯度稀释成系列供试样品（连续稀释7次，终浓度为0.16 mg/ml）备用。长成单层的Vero 细胞用含不同浓度药物的培养液孵育，以生理盐水作对照，每24  h观察细胞致病作用（CPE）产生的情况，观察72 h。
       1.2.2  病毒效价滴定病毒悬液连续稀释，常规方法感染单层Vero 细胞,37℃，5% CO2培养箱培养，每24 h观察CPE产生的情况，观察72 h。
       1.2.3  对HSV病毒的直接杀灭作用含不同浓度夏枯草多糖的溶液与等量病毒液(40 μl)混合后，置37 ℃，5% CO2培养箱中作用1 h，加入含vero细胞的培养液，混匀，设病毒对照组（病毒、vero细胞）、细胞对照组（vero细胞）、样品对照组（样品、vero细胞），置于37℃，5% CO2培养箱中培养，每24 h观察CPE产生的情况，观察72 h。
       1.2.4  对细胞的保护作用以不同浓度夏枯草多糖溶液加到单层Vero 细胞孔中，培养1 h，再加入病毒液40 μl，混匀，设病毒对照组（病毒、vero细胞）、细胞对照组（vero细胞）、样品对照组（样品、vero细胞），置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，每24 h观察CPE产生的情况，观察72 h。
       1.2.5  小鼠脾脏细胞制备将小鼠处死, 75%酒精浸泡，无菌获取脾脏，分离单个核细胞（PBL），计数细胞，用含10%FCS的RPMI-1640调整PBL浓度为5×106个/ml，待用。
       1.2.6  淋巴细胞增殖转化实验采用3H-TdR掺入实验。小鼠脾细胞悬液（5×106/ml），加入96孔圆底细胞培养板内，100 μl/孔。分别加入ConA10 μg/孔，不同浓度多糖样品溶液（100，50，10，1 μg/ml），置37 ℃， 5%CO2培养箱培养72 h。终止实验前16 h加入3H－TdR 37 μGBq/孔。用细胞收集仪将细胞吸附在玻璃纤维滤纸上，闪烁仪测得cpm值并计算刺激指数（stimulating index，SI）=实验组cpm均值/对照组cpm均值。
       1.2.7  细胞因子诱生实验按照细胞因子检测试剂盒操作手册，采用双抗夹心法分别检测各小鼠脾脏细胞经过ConA刺激后细胞培养上清中IFN-γ的含量。
       2  结果
       2.1  样品细胞毒性测定实验结果表明，夏枯草粗多糖及纯化多糖各组分在20 mg/ml浓度以下均无细胞毒性。
       2.2  病毒效价滴定经扩增后，病毒效价符合要求。病毒稀释至200TCID50后使用。
       2.3  抗病毒实验实验结果表明，直接杀灭及预防给药2种方式作用下，夏枯草粗多糖及各多糖组分（20 mg/ml）分别在24，48 h内可减轻CPE，直接杀灭病毒作用较弱。
       2.4  淋巴细胞转化实验结果见表1。表1  淋巴细胞转化增殖实验结果（略）
        实验结果表明，供试的夏枯草多糖(XKC02-B 10 μg/ml以上；XKC02-A，XKC00，XKC02，XKC10 50 μg/ml以上；XKC05，XKCc100mg/ml以上 )体外均能明显促进淋巴细胞转化增殖，且有明显的剂量依赖性。其中XKC02-B促进淋巴细胞转化增值效果最明显。
       2.5  细胞培养上清细胞因子的检测
       2.5.1  标准曲线的绘制IFN-γ浓度在15.625～1 000 pg/ml范围内线性良好，标准曲线为y=0.001 6x+0.050 9（r=0.999 6）。
       2.5.2  样品的测定结果见表2。表2  IFN-γ诱生实验结果（略）
        实验结果表明，除XKC10外，供试的夏枯草多糖一定浓度下体外均能明显诱生IFN-γ。
       3  讨论
        淋巴细胞增殖转化实验结果表明，供试的夏枯草多糖XKC00，XKC02，XKC05，XKC10，XKC02-A，XKC02-B，XKC-C体外均能明显促进淋巴细胞转化增殖，且有明显的剂量依赖性。夏枯草多糖促进淋巴细胞转化增殖可能是其发挥抗病毒作用的机理之一。
        细胞因子诱生实验结果表明，供试的夏枯草多糖XKC00，XKC02，XKC05，XKC02-A，XKC02-B，XKC-C均能明显诱生IFN-γ。而干扰素能活化多个基因，包括2个有直接抗病毒活性的：①67kDa蛋白激酶：抑制eIF-2的磷酸化，阻止蛋白质的转译；②2，5，－寡腺苷酸合成酶：活化降解病毒RNA的核酸内切酶（Rnase L）。干扰素除直接抑制病毒复制外，尚能增强MHC I和II类分子表达以促进适应性免疫应答，并且还能活化巨噬细胞和NK细胞，加强其抗病毒活性［3］。而NK细胞是疱疹病毒的主要效应细胞，对病毒感染细胞有细胞毒性。夏枯草多糖诱生干扰素可能也是其发挥抗病毒作用的另一个机理。
        抗病毒实验和免疫学实验研究结果表明：夏枯草多糖用于单纯性疱疹的治疗作用，可能不是由对病毒的直接作用引起的，而是通过促进淋巴细胞转化增殖和诱生干扰素等免疫调节作用的结果。在生殖泌尿道的固有层和黏膜下区存在着积聚的非包膜淋巴组织，并且人体器官的黏膜中也存在着大量的淋巴细胞，提示夏枯草多糖可以通过黏膜给药的方式直接作用在HSV感染者的患处发挥治疗作用。
        论文抗病毒研究部分得到上海交通大学医学院微生物教研室肖家祁老师的指导，特此致谢！
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:197.
       
       ［2］Hong-Xi Xu,Spencer H.S. Lee,Song F.Lee,Robert L. White,Jonathan Blay.Isolation and characterization of an anti-HSV polysaccharide from Prunella vulgaris［J］Antiviral Research 1999,44:43.
       
       ［3］陈慰峰.医学免疫学，第4版［M］.北京：人民卫生出版社，2004:66.