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       【摘要】 
       目的通过pH循环实验研究中药五倍子、蜂房提取物对人工早期釉质龋的再矿化作用。方法应用离体牛切牙制备人工釉质龋标本40 例,随机分为4组：(a) 去离子水组 (阴性对照)、 (b) 五倍子组、 (c) 蜂房组、(d) NaF组(阳性对照)，进行体外pH循环实验后，采用显微硬度计测定标本脱矿前后和pH循环后的硬度值,观察釉质表面显微硬度的变化。通过偏光显微镜观察早期釉质龋损再矿化后的病理学改变。结果NaF组(阳性对照)和五倍子组能明显的提高早期釉质龋的表面显微硬度（P<0.05），蜂房组虽然也能提高釉质龋的表面显微硬度，但与去离子水组(阴性对照)比较无统计学意义（P>0.05）。偏光显微镜下，pH循环后NaF组(阳性对照)和五倍子组表层明显增厚,密度增加，病损体部出现呈负性双折射的再矿化条带，病损深度也明显变浅。结论五倍子能有效促进早期釉质龋再矿化,因而具有防龋功效。
       【关键词】  五倍子 蜂房 早期龋 再矿化
       Abstract:ObjectiveTo evaluate the effect of extracts of Galla chinensis and Nidus Vespae on the remineralization of initial enamel carious lesions in vitro. MethodsForty bovine enamel blocks with early lesions were prepared and randomly divided into four treatment groups.The lesions were subjected to a pH-cycling regime for 12 days. Surface enamel microhardness was measured on the enamel blocks before and after demineralization  by polarized light microscopy. ResultsAll samples rehardened significantly. Fluoride had a significantly greater effect than all other treatments. In the Galla chinensis group, %SMHR was significantly greater than DDW. There was no significant difference between the Nidus Vespae group and DDW. Polarized light microscopy showed that the thickness of the surface layer increased obviously in all specimens including NaF group and Galla chinensis group.Negative birefringent band appeared in the lesions body and the depth of the lesions was obviously reduced .ConclusionThese results showed that extracts of Galla chinensis can obviously promote the remineralization of the early enamel carious lesions, so it appears to be a promising source of new agents that may prevent dental caries.
       Key words:Galla chinensis;   Nidus Vespae;   Initial enamel lesions ;  Remineralization
        龋病是发生在牙齿硬组织的一种慢性细菌性疾病，发病率高，分布广，严重影响人类口腔及全身健康。含氟制剂的使用是目前龋病预防最常用的方法，但氟制剂的使用具有明显的局限性，如氟斑牙、氟骨症等。因此，寻找新的安全、有效的防龋药物越来越受到龋病防治领域学者们的重视。
        近年来中药在龋病防治方面的研究倍受关注，中药具有清热解毒、调节平衡等作用。五倍子, 别名文蛤、百虫仓、木附子等，具有敛肺降火、涩肠止泻、敛汗止血、收湿敛疮等功效。蜂房又称露蜂房、野蜂房、马蜂窝，为胡蜂科昆虫大黄蜂或同属近缘昆虫的巢，具有消肿散结，攻毒杀虫，祛风熄风的功效。本课题组前期研究发现，中药五倍子、蜂房对口腔中与龋病发生关系密切的细菌有明显的抑制作用，五倍子还能抑制釉质脱矿，且与氟具有协同作用［1～6］。但五倍子、蜂房对早期釉质龋的再矿化作用如何，目前尚未见报道。本研究通过体外实验对五倍子、蜂房提取物对人工早期釉质龋的再矿化作用进行研究，进一步明确五倍子、蜂房的防龋功效，为五倍子、蜂房防龋的推广应用奠定基础。
       1  材料与方法
       1.1   五倍子、蜂房提取物的提取
       五倍子为四川产五倍子Rhus chinesis Mill，购于成都中药材市场，提取物由四川省天然药物研究重点实验室提供。提取方法为：1 000 g五倍子粉碎，以3 000 ml去离子水于60～70℃水浴10 h，振摇，过滤，滤渣，重复上次操作，合并滤液，加活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至稠膏状，得五倍子粗提物；蜂房为四川产露蜂房Polistes mandarinus Sauss，购于成都中药材市场，提取物由四川省天然药物研究重点实验室提供，提取方法为：1 000 g蜂房粉碎，先后以95%乙醇，50%乙醇浸渍后渗漉, 将渗漉液浓缩至稠膏,为蜂房粗提物。
       1.2  釉质的预备选择新鲜拔除的牛切牙,除去表面有机污染物，分离冠根, 冠部超声清洗，干燥，显微镜下观察无龋损、氟斑、裂痕。用硬组织切割机将牙冠成5 mm×5 mm×2 mm大小的釉质块，唇面釉质用抛光机及碳化硅砂纸（800#，1 200#，2 400#）在流水下依次磨平、抛光。然后由显微硬度计(Knoop压头，50-g，15 s)测量基线表面显微硬度（surface microhardness, SMH）,于每个标本釉质表面中央垂直测5个点，选择硬度值范围为298.30～ 313.80 KHN(Knoop hardness number, KHN)釉质块65个，超声清洗，自然干燥，釉质块表面开窗4 mm×4 mm大小，其余部位涂布两层抗酸指甲油。
       1.3  人工龋实验将预备好的釉质标本用嵌体蜡固定在自制的环形玻棒上，放入盛有脱矿溶液（2.2 mmol/L Ca(NO3)2，2.2 mmol/L KH2PO4，50 mmol/L醋酸，1.0 mmol/L NaN3，0.1 ppmNaF，pH用5 mol/L的KOH调至4.5）的玻璃器皿中，釉质表面与溶液的比率为20 mm2/10 ml，磁搅拌仪搅拌（100 r/min），37℃脱矿3 d。脱矿后再次测量其表面显微硬度（在基线测量点一侧平行测5个点），选择硬度值范围为166.80～176.50 KHN釉质块40个用于再矿化实验。每个样本所开窗口的一半用抗酸指甲油覆盖作为再矿化实验前后形态学对照。
       1.4  再矿化实验40个人工釉质龋样本随即分为4组（10个/组），即：(a) 去离子水组(阴性对照)， (b) 五倍子组， (c) 蜂房组，(d) NaF组(阳性对照)。各实验组药物浓度都为4 g/L，pH值用2M NaOH调至7.0。然后各组分别进行pH循环实验，共循环12 d，其每天的具体方案［7］见表1。表1  再矿化pH循环实验方案（略）
       1.5  显微硬度测量pH循环结束后，用显微硬度仪(Duramin -2, Struers公司，丹麦，Knoop压头，50-g,15 s)于各标本暴露窗口再次测量表面显微硬度（在基线测量点的另一侧平行测5个点），然后对3次不同时间（脱矿前、脱矿后、pH循环后）侧得的所有5个硬度值的平均值进行比较并计算出表面显微硬度恢复的百分比（%SMHR），计算公式［8］如下：
        %SMHR=（pH循环后的硬度值-脱矿后的硬度值）（基线硬度值-脱矿后的硬度值）×100
       1.6  偏光显微镜观察表面显微硬度测试后，用自凝塑胶将牙齿包埋，硬组织切割机从釉质开窗区的中央将牙齿锯开，切成约300μm厚的牙片，然后流水下磨制成薄片，约100 μm，经水浸渍后用偏光显微镜(ECLIPSE ME600L , Nikon公司，日本)观察，数码影像由专用软件ACT-1获取。
       1.7  统计分析统计学分析均采用SPSS11.5处理，再矿化前后的显微硬度值的比较选用配对t检验，各组表面显微硬度恢复的百分比（%SMHR）的比较选用单因素方差分析及其两两比较。
       2  结果
       2.1  表面显微硬度结果见表2。由表2可见再矿化前后显微硬度值比较，实验各组都能提高脱矿釉质的表面显微硬度（P<0.05），但组间比较，表面显微硬度的提高则有显著的不同，通过方差分析，各组表面显微硬度恢复的百分比之间具有显著的统计学意义（P<0.05），由两两比较可见，除了蜂房原药组与去离子水组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余各组之间都具有显著的统计学意义（P<0.05），其中NaF组（阳性对照组）硬度恢复的百分比最高，去离子水组（阴性对照组）最低。表2   各实验组牙釉质表面显微硬度分析(略)
       2.2  偏光显微镜观察偏振光显微镜下观察，再矿化前制备的人工龋为典型的表层下脱矿表现,具有负性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部（图1～4）。再矿化后，五倍子组龋损表层明显增厚,密度增加，病损体部出现呈负性双折射的再矿化条带，病损深度也明显变浅，但不如NaF组（图2，4）。而蜂房原药组和去离子水组除龋损表层密度稍有增加外，与矿化前比无明显变化（图1，3）。
       3  讨论
        五倍子、蜂房是近年来研究较多的防龋中药，本实验采用体外化学模型—pH循环对其矿化作用进行了系统研究。
        研究证明，釉质表层矿物质含量的变化与其显微硬度的改变有直接的关系，早期釉质龋的显微硬度随着釉质龋的再矿化而增加［9］。通过表面显微硬度测量发现，五倍子组有明显的再矿化作用，显微硬度恢复的百分比（%SMHR）与阴性对照组（去离子水组）比较具有统计学意义，但与阳性对照组（NaF）相比，%SMHR低于NaF组，说明其再矿化作用不如NaF。而蜂房处理的釉质样品表面显微硬度恢复的百分比与阴性对照组（DDW组）比较无统计学意义，可见该组未发生再矿化作用。
        偏振光显微镜下观察，五倍子组和阳性对照组（NaF组）与再矿化前人工龋损相比病损深度明显变浅，龋损表层明显增厚,密度增加，病损体部出现与表层一样呈负性双折射的层状条带，为龋损中的再矿化区域，这些现象表明这两组均发生了明显的再矿化，而蜂房组和阴性对照组（去离子水组）除了龋损表层密度稍有增加，与再矿化前比变化不甚明显。通过以上形态学研究再次证明五倍子能促进早期龋的再矿化，而蜂房无明显矿化作用，其结果与表面显微硬度测量结果一致。本实验通过样本再矿化前后形态学自身对照，避免了不同样本之间的不均一性，准确地反映了再矿化是部分溶解的晶体被来源于溶液中的钙磷离子沉积诱导而增长的过程。五倍子中的主要成分为鞣质及没食子酸。研究证明，鞣酸能与细胞外或组织外的钙离子的络合，形成难溶性的络合物，食物中的鞣酸能影响人体对钙离子的吸收［10，11］。结果表明，五倍子对早期釉质龋具有再矿化作用，其再矿化主要发生在表层和表层下，故推测五倍子再矿化的作用机制可能是鞣酸与溶液中的钙离子发生反应形成络合物，通过釉质表面微孔道渗透进龋损内部，促进钙离子沉积，从而引导部分溶解晶体增长促进了再矿化。
        本研究通过体外pH循环实验，发现五倍子有促进早期釉质龋再矿化的作用，虽然效果不如氟化钠，但作为一种非氟的防龋药物，仍具有重要的研究前景和应用价值。
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