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       【摘要】 
       目的观察红景天对肺纤维化大鼠肺组织I型胶原、转化生长因子β1（TGF-β1）及其信号通路分子Smad4表达的影响，探讨红景天对大鼠肺纤维化的防治作用与机制。 方法健康SD大鼠40只随机分为4组：模型组（A组），正常对照组（B组），红景天14 d治疗组（C组），红景天28 d治疗组（D组）各10只。博莱霉素（BLM）气管内滴入建立大鼠肺纤维化模型，正常对照组气管内滴入生理盐水。在造模的第2日治疗组予红景天0.21 g/kg灌胃干预，于第14，28日取肺组织，运用组织芯片结合图象分析技术，通过苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织病理学改变，用免疫组化检测I型胶原蛋白和TGF-β1的表达，实时荧光定量RT-PCR检测I型胶原和TGF-β1 的mRNA表达，原位杂交技术对Smad4 mRNA进行定位定量分析。 结果红景天在两时相皆抑制I型胶原，TGF-β1的表达。C组I型胶原蛋白的IOD值为（0.362±0.241），D组I型胶原蛋白IOD值为（0.334±0.122），与A组（0.513±0.384）相比有统计学意义（P均<0.05）。C组TGF-β1蛋白的IOD值为（0.062±0.013），D组TGF-β1蛋白IOD值为（0.058±0.011），与A组（0.100±0.005）相比有统计学意义（P均<0.05）。C组I型胶原mRNA相对表达量为（0.041±0.017），D组I型胶原mRNA相对表达量为0.040±0.021，与A组0.071±0.054相比有统计学意义（P均<0.05）。C组TGF-β1 mRNA相对表达量为（0.0025±0.0013），D组TGF-β1mRNA相对表达量为（0.0030±0.0005），与A组（0.0170±0.0157）相比有统计学意义（P均<0.05）。肺组织Smad4 mRNA表达呈局灶性，在炎症和胶原沉积部位表达较明显，而治疗组和模型组比较无统计学意义（P均>0.05）；治疗组Smad4 mRNA表达量与正常对照组（0.165±0.099）比较亦无统计学意义（P>0.05）。 结论 红景天对大鼠肺纤维化具有一定治疗作用，其机制可能是通过抑制I型胶原及TGF-β1表达，从而干扰TGFβSmads信号通路对基因表达、蛋白合成的调节而实现的。
       【关键词】  红景天 肺纤维化 Ⅰ型胶原 转化生长因子β1 组织芯片 实时荧光定量PCR
       AbstractObjectiveTo study the protective effect and mechanism of integripetal rhodiola herb(IRH) on rats with pulmonary fibrosis.  MethodsForty SD rats were divided randomly into four  groups (Group A：fibrosis model group, 10 rats. Group B：normal group, 10 rats. Group C：14 day-treatment group with IRH, 10 rats. Group D：28 day-treatment group with IRH, 10 rats). In the model group and the treatment group, pulmonary fibrosis was reproduced by the intratracheal injection of bleomycin (BLM). In the normal control group, normal saline was given intratracheally. IRH was administered intragastricly from day 1 till day 28 after modeling with a dose of 0.21 g/kg in the group C and D, while the normal saline was given intragastricly in the other groups. On the 29th day, rats were sacrificed. HE staining were undertaken after lung tissue was made into tissue microarray slices. CollagenⅠand transforming growth factor beta 1(TGF-β1) were tested by methods of immunohistochemical staining and real time quantitative PCR. Expression of Smad4 mRNA  was tested by in situ hybridization. ResultsThe expressions of CollagenⅠin group C(0.362±0.241) and group D(0.334±0.122) were much lower than that of group A (0.935±0.377，P<0.05). The expressions of TGF-β1 in group C(0.058±0.011) and group D(0.062±0.013) were much lower than that in group A (0.100±0.005，P<0.05). The expressions of CollagenⅠmRNA in group C(0.041±0.017) and group D(0.040±0.021) were much lower than that of group A (0.071±0.054，P<0.05). The expressions of TGF-β1 mRNA in group C(0.0025±0.0013) and group D(0.0031±0.0005) were much lower than that in group A (0.0170±0.0157，P<0.05). The IOD of Smad4 mRNA in treatment groups were no significant different from that in model group (P>0.05). ConclusionSignificant enhancement of the expressions of CollagenⅠand TGF-β1  were observed in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis. IRH has a preventive effect against pulmonary fibrosis. Inhibitting the expressions of pulmonary CollagenⅠand TGF-β1 may be one of the  mechanisms.
       Key wordsIntegripetal rhodiola herb；  Pulmonary fibrosis；  CollagenⅠ  transforming growth factor beta 1；  Tissue microarray；  Real-time quantitative polymerase chain reaction(real-time Q-PCR)
        红景天为景天科红景天属多年生草本植物，全世界共有96种，分布在北半球的高寒地带。其中我国有73种，主要分布于东北、华北、西北及西南，有较为广泛的临床药用价值［1］。目前较为常用的有高山红景天和西藏圣地红景天，尤以生长在西藏的圣地红景天(藏语：苏罗玛宝)为上品。近年来对红景天药理学和临床应用研究较多，目前已从红景天中分离鉴定出化学成分主要包括：红景天苷、酪醇、黄酮类化合物以及淀粉、蛋白质、脂肪、酚类化合物和微量元素铁、铝、锌、钴、镉、钛、铜、锰等［2］。红景天的胶囊制剂诺迪康是采用现代科学方法，选用生长在西藏高原 (海拔高度3 500～5 000 m地带)圣地红景天为原料精制而成，其主要成分由红景天苷、酪醇、多种黄酮、18种氨基酸、多种微量元素和丰富的维生素A，D，E等组成。目前临床主要用于治疗和预防冠心病心绞痛，用于肺纤维化治疗的报道不多［3］。肺纤维化是一个复杂的病理生理过程，是肺对各种原因所致肺损伤的创伤愈合反应，最终肺内结缔组织增生、沉积形成纤维化。在纤维化形成过程中，转化生长因子β1（TGF-β1）起重要作用，它能趋化、刺激成纤维细胞合成间质生长因子和细胞外基质成分［4～6］，形成胶原并大量沉积导致器官纤维化。近年来，传统中药治疗肺纤维化成为抗肺纤维化领域的研究热点之一。我们选用藏药红景天，通过观察其对肺纤维化大鼠肺内I型胶原，TGF-β1及其信号通路分子Smad4表达的影响，旨在探讨红景天对肺纤维化的防治作用及机制。
       1  材料与方法
       1.1   材料  
       1.1.1  动物和试剂
       SD健康大鼠40只，雌雄各半，体重150～250 g，购于四川大学华西动物中心；红景天（诺迪康，批号：040209，四川诺迪康威光制药有限公司生产）；博莱霉素(批号Y32480，15 mg/支，日本化药株式会社)，I型胶原、TGF-β1免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，RT-PCR试剂盒 (立陶宛MBI公司)，引物探针(上海生物工程有限公司)，Trizol(美国MRC公司)，Smad4 mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
       1.1.2  仪器与设备
       FTC-2000型荧光定量基因扩增仪(加拿大枫岭公司)，美国Image-pro plus 专业图像分析软件系统(美国Media Cybernetics公司)。
       1.2  方法
       1.2.1  动物处理按性别及体重分为4组，模型组（A组），正常对照组（B组），红景天14 d治疗组（C组），红景天28 d治疗组（D组）各10只。采用博莱霉素造模［6］，方法如下：大鼠经氯胺酮麻醉后，无菌操作下切开大鼠颈前皮肤，钝性分离气管，经气管灌入博莱霉素（5 mg/kg，溶于0.3  ml生理盐水）后，立即将大鼠直立并左右旋转使药物均匀灌入双肺，缝合皮肤。对照组大鼠经气管内灌入同等体积的生理盐水。第2天C，D组用红景天0.21 g/kg灌胃，A，B组用同等体积生理盐水灌胃，共28 d。
       1.2.2  标本收集A，B组动物于给药后第29天称重后用速眠新Ⅱ1 ml/kg（846合剂）肌注麻醉后处死。C组大鼠于第15天，D组大鼠于第29天处死。取右肺下叶用锡薄纸包裹后于液氮罐中速冻保存；经左主支气管灌注4%多聚甲醛直至左肺完全膨胀后，将其置于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定，制成石蜡块。
       1.2.3  制作组织芯片用石蜡先于包埋盒中制备空白蜡块，2 mm口径打孔器于空白蜡块上按设计阵列打30孔。再用打孔器于每个标本蜡块上的组织区域钻孔切割取直径2 mm点柱。将点柱捅出打孔器后，放于空白蜡块的孔洞内。空白蜡块上的孔洞全填上点柱后微熔蜡块，使点柱与周围石蜡溶合，然后将已完全融化的石蜡倒入包埋盒将外露的点柱融盖，再用钢针于酒精灯上加热后修整融合点柱，排出气泡，再将包埋框放于包埋盒上，倒入少量熔化石蜡使包埋框与蜡块融合并作好标记，放于冰箱4℃冷却。取出蜡块，含30个点阵的组织芯片蜡块制作完成。
       1.2.4  石蜡切片行苏木素－伊红染色观察肺部病理改变程度用免疫组化（SP）法检测大鼠肺组织I型胶原和TGF-β1表达，实验操作依照免疫组化试剂盒说明书进行。原位杂交检测Smad4 mRNA表达，依原位杂交试剂盒说明书进行。
       1.2.5  图像采集、处理及定量分析由TE2000-u倒置生物显微镜、COOLPIX450高级数码像机及 Image-pro plus 专业图像分析软件构成图像采集和分析系统。定量方法：于切片左右上下4个视野各采集1张100倍的图像，自动计算Ⅰ型胶原、TGF-β1和Smad4 mRNA积分光密度(IOD)值。4张图像的IOD平均值作为该片指标的代表值。
       1.2.6  实时荧光定量RT-PCR检测肺组织Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA表达先提取组织总RNA，步骤：取新鲜冷冻保存的组织，剪取50～80 mg放入玻璃匀浆器中，先用超声碎化组织后加入1 ml Trizol制成匀浆, 室温放置5 min，使样品充分裂解，将匀浆液转入1.5 ml EP管中，4℃，12 000 r/min离心10 min。将上清液移入另一EP管，室温放置5 min，加200 μl氯仿，盖紧盖子，用力振荡15 s，放置3 min，待其自然分层。12 000 r/min离心10 min，然后吸取含总RNA的上层水相至另一离心管中。加0.5 ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10 min。4℃，12 000 r/min离心10 min，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。加75％乙醇1 ml，颠倒混匀，洗涤RNA。4℃，7 500 r/min离心5 min，去掉乙醇留沉淀，共2次。空气中干燥5 min，加100 μl经DEPC处理的灭菌双蒸水，于-80℃冷冻保存。
        两步法RT-PCR扩增目的基因：（1）引物：Ⅰ型胶原上游引物5"－ CCTCCTGGCTTCCCTG －3"，下游引物5"－CAGCACCAGGGTTTCCAGCA－3"，TaqMan探针5"－CTCACCACGCACACCCTG－3"。TGFβ1上游引物5"－ actactgcttcagctccaca－3"，下游引物5"－gtgtccaggctccaaatgt－3"，TaqMan探针5"－ccaagggctaccatgccaac －3"。内对照基因GAPDH上游引物5"－tgggtgtgaaccacgagaa－3"，下游引物5"－ggcatggactgtggtcatga－3"，TaqMan探针5"－ctgcaccaccaactgcttagc－3"。（2）制备模板cDNA：在0.2mlEP管中加入2 μl总RNA，再加入DEPC-H2O，使总体积为8μl。加入0.5 μl 核糖核酸酶抑制剂，2 μl随机引物，小心混匀。65℃保温5 min，室温放置10 min，室温高速离心5 s，将所有溶液收集到管底。按次序分别加入下列试剂：4 μl 5×First-strand Buffer，0.5 μl ribonuclease inhibitor，2 μl dNTP Mix，2μl DTT，1 μl MmuLV Reverse Transcriptase，混匀，37℃保温1 h。90℃处理5 s，冰上冷却，室温高速离心5 s，将所有溶液收集到管底，用于PCR扩增或-20℃保存备用。（3）扩增目的基因：①制作标准曲线：用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5    μl，分别加入30 μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR，具体步骤如下：3 μl 10×Buffer，3 μl 25 mmol/L MgCl2，0.9 μl 10 mM dNTP，1 μl 10 μmol/L上游引物，1 μl 10 μmol/L下游引物，1 μl 10 μmol/L TaqMan探针，0.3 μl TaqDNAPolymerse(5U/μl)，14.8 μl DEPC-H2O，5 μl cDNA模板，总体积30 μl。反应体系在FTC2000型荧光定量PCR仪上进行。扩增条件如下：94℃预变性1 min，94℃变性10 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，共45个循环。45个循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。然后以每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（Ct值）为纵坐标，以标准品的各稀释度的起始靶DNA拷贝数的对数值为横坐标做标准曲线。②待测组织目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cDNA样品中各取5 μl，加入和上面完全相同的反应体系中，在同样的反应条件下行PCR扩增。收集数据，绘制动力学曲线，测定各样品的Ct值与标准曲线进行比较，根据说明书上的步骤计算得出待测样品的相对拷贝数。在PCR反应过程中，设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照。
        据上述方法分别计算出各个标本待测靶基因和内对照基因的相对拷贝数，再将各待测样本靶基因的相对拷贝数除以其内对照基因的相对拷贝数，获得校正拷贝数，然后转化为自然对数，计算各均值，作为该标本的代表值。
       1.3  统计学处理 
       全部资料采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），数据采用±s表示。
       2  结果
       2.1  镜下组织病理学结果  
       肺组织HE染色见C组肺组织无明显异常，A组大鼠肺内病变范围广，表现为明显的肺泡炎，肺泡腔和肺间质均有大量的多核及单核细胞浸润和红细胞渗出。大量肺泡结构破坏或消失，肺泡间隔增厚，有胶原沉积及斑片状的纤维化形成。C，D组肺纤维化程度明显减轻，炎性细胞浸润和胶原沉积较A组少。
       2.2  各组大鼠肺组织Ⅰ型胶原表达量比较   
        
       A组Ⅰ型胶原蛋白表达与B组相比较明显增高（P< 0.05）。C，D组的Ⅰ型胶原蛋白和A组比较明显减少（P< 0.05）。C，D，B 3组之间比较无统计学意义（均*P>0.05），见表1。A组Ⅰ型胶原mRNA表达与B组相比较明显增高（P< 0.05）。C，D组的Ⅰ型胶原mRNA和A组比较明显减少（P< 0.05）。C，D，B 3组之间比较无统计学意义（均*P>0.05），结果见表1。表1  各组大鼠Ⅰ型胶原mRNA，TGF-β1mRNA和Smad4 mRNA比较(略)
       2.3  各组大鼠肺组织TGF-β1表达量比较  
       A组大鼠TGF-β1蛋白较B组明显增高（P<0.05），C，D组的TGF-β1和A组比较明显减少（P<0.05），而C，D，B三组之间比较无统计学意义（P>0.05），见表1。A组大鼠TGF-β1mRNA较B组明显增高（P<0.05），C，D组的TGF-β1mRNA和A组比较明显减少（P<0.05），而C，D，B 3组之间比较无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。表2  各组大鼠Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1IOD值的比较(略)
       2.4  各组大鼠肺组织Smad4 mRNA比较     
       原位杂交染色可见，A组肺组织肺泡壁明显增厚，在增厚的肺泡壁及血管周围可见明显Smad4 mRNA表达，呈局灶性。C、D组肺组织炎症及损伤明显减轻，不均匀增厚的肺泡间隔可见散在Smad4 mRNA表达；B组肺组织形态正常，可见少许散在炎性区，Smad4 mRNA表达不明显。但各组大鼠肺组织Smad4 mRNA组间均没有明显差别（P>0.05）。
       3  讨论
        肺纤维化是肺组织对各种原因所致肺损伤的创伤愈合反应。肺受损伤后首先表现为肺泡炎，然后组织修复，在组织修复的过程中可能会出现胶原的过度沉积而最终导致肺纤维化。在肺脏沉积的胶原中Ⅰ型胶原沉积不可逆转［7］。本实验观察到，滴注博莱霉素后1个月，模型组大鼠Ⅰ型胶原表达量明显增加（P<0.05），提示造模后大鼠肺组织胶原沉积有较明显的出现。对比红景天治疗组和模型组后发现，红景天干预后肺组织炎症明显减轻，Ⅰ型胶原及TGF-β1表达亦明显减少（P<0.05），说明红景天对肺泡炎的形成、肺组织胶原沉积有明显的抑制作用。TGF-β1是肺纤维化发病机制中重要的细胞因子之一，其生物学功能极其复杂［8］。TGF-β1可增强胶原表达，促进细胞外基质沉积，并可与其它细胞因子相互作用，形成复杂的细胞因子网络，通过细胞内信号传导产生复杂生物学效应，导致肺纤维化。在肺纤维化动物模型以及人类特发性肺纤维化中，肺组织TGF-β1水平都是升高的，TGF-β1抗体及TGF-β1受体拮抗剂都能减弱博莱霉素所致的肺内胶原沉积［9］。本研究同样发现肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1 基因及蛋白水平显著升高，与文献报道相符，进一步证实了TGF-β1在肺纤维化的发生发展过程中发挥一定的作用。而Smad4作为TGF-β1信号传导的下游分子，参与TGF-β1信号传导。我们通过原位杂交染色法发现，Smad4 mRNA在肺的血管周围、肺泡间隔等Ⅰ型胶原表达明显增强的部位出现浓聚，而在Ⅰ型胶原表达不明显、肺泡炎症程度低的部位表达相应减少，亦提示Smad4 mRNA的表达可能参与了肺纤维化过程。
        红景天主要成分为红景天苷、酪醇和多种黄酮，它能增加清除体内自由基，减轻血管内皮损伤，改善血黏度［10，11］ ，本研究对大鼠采用红景天处理后，Ⅰ型胶原和TGF-β1的蛋白及基因表达均呈下降，肺纤维化的程度减轻，说明其对肺纤维化具有一定的治疗效应，与文献报道相符［12］。本实验结果为红景天的进一步开发和应用提供了基础理论依据，今后应更深入研究红景天多种化学成分的药理学作用。我国中药藏药资源丰富，但是开发程度有限，积极研发利用传统资源，更好地体现它们的药用价值可能是今后中药现代化发展的方向。本实验红景天干预后大鼠Ⅰ型胶原，TGF-β1表达下调，可能是红景天缓解博莱霉素所致大鼠肺纤维化的重要机制之一。
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