健中愈疡片对胃溃疡线粒体DNA修复酶调控机制的实验与临床研究
作者：姬爱冬
《时珍国医国药》 2007年 第11期
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【摘要】
目的从分子水平探讨健脾益气方药在胃溃疡黏膜损伤修复过程中对线粒体DNA修复酶的调控机制及观察愈合质量，深入探讨线粒体DNA修复酶对胃溃疡的胃黏膜的修复逆转作用及中药的作用靶点。方法用临床观察和动物实验研究健脾益气方药对胃溃疡胃黏膜的保护与修复作用。比较健中愈疡片、黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃黏膜线粒体 8－氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3－甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影响，并进行健脾益气方药与黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃溃疡愈合质量的比较和评价。结果正常组线粒体DNA修复酶含量很低，胃溃疡组线粒体DNA修复酶含量很高，健中愈疡片组线粒体DNA修复酶含量较正常组极显著增高（P<0.01），胃舒平组线粒体DNA修复酶含量与胃溃疡组没有差异(P>0.05)，法莫替丁组线粒体DNA修复酶含量比胃溃疡组减少(P<0.05)。而溃疡愈合质量则健中愈疡片组和法莫替丁组没有差异(P>0.05),二者均好于胃舒平组(P<0.05)；在脾虚证的改善上, 健中愈疡片组明显优于法莫替丁组和胃舒平组(P<0.01)。结论 健中愈疡片对胃溃疡的治疗机理之一是对线粒体DNA修复酶进行了调控，提高了修复因素，这是其作用靶点之一；而法莫替丁和胃舒平组治疗机理分别是减少损害因素和进行物理保护，其作用与线粒体DNA修复酶关系不甚密切；但对脾虚症状的改善上，健中愈疡片的作用远远高于西药组，显示了中医药治疗的优越性。
【关键词】 健中愈疡片 胃溃疡 线粒体DNA修复酶
Abstract:ObjectiveClinical practice has proved that invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese formulated products -Jian Zhong Yu Yang Tablet(JZYYT) has good curative effect on tough gastric ulcer. Our research is to reveal how the invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs regulate the mitochondrion DNA repair enzymes, to reveal how Chinese drugs cure gastric ulcer, and to find the target of Chinese drugs.MethodsOur study was to treat gastric ulcer by invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs through clinical observation and experimental research, and compared with mucosa protectant -gastropine and H2 receptor antagonist -famotidine about the mucosa mitochondrion 8-oxygen guanine DNA glycosylase, thymine glycol DNA glycosylase,3-methyl adenine DNA glycosylase, the effect of gastralgia, splenic asthenia and quality of ulcer recovery.In clinical research, we observed the rank of gastralgia, splenic asthenia and compositive therapeutic effects. In animal experiment, we detected the body weight, frequency of twisting in unit time, suspending time, index number of gastric ulcer, and microcirculation of gastric mucosa such as the value of B/(R+G+B) to clarify the regulation effect of invigorating spleen and benefiting vital energy Chinese drugs on mitochondrion DNA repair enzymes, and the therapeutic effect on gastric ulcer in molecular level.ResultsMitochondrion DNA repair enzymes were the lowest in the gastric mucosa of normal group, but they were very high in gastric ulcer group, there had significant difference between them（P<0.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes had no difference between gastropine group and gastric ulcer group（P>0.05）；Mitochondrion DNA repair enzymes in famotidine group decreased extremely compared with gastric ulcer group（P<0.01）,but still extremely higher than normal group（P<0.01）；Mitochondrion DNA repair enzymes were the highest in JianZhongYuYang Tablet group, and had extreme differences compared with each of the other 4 groups（P<0.01）. Grade of gastralgia：before treatment ,there had extreme differences between normal group and the other 4 groups（P<0.01），there had no differences among the other 4 groups（P>0.05）.After treatment, grades of gastralgia in JianZhongYuYang Tablet group and famotidine group were the lowest, and had no difference between them（P>0.05）；the grade of gastralgia in gastropine group was lower, there had extreme difference compared with gastric ulcer group（P<0.01），but also had extreme differences compared with JianZhongYuYang Tablet group and famotidine group. In the difference of grade of gastralgia before and after treatment, JianZhongYuYang Tablet group had no difference compared with famotidine group（P>0.05），but gastropine group had obvious difference compared with JianZhongYuYang Tablet group（P<0.05），and had extreme differences compared with famotidine group（P<0.01）. Syndrome of splenic asthenia：before treatment ,the rank of splenic asthenia in each group was balanced except normal group. After treatment, the change of splenic asthenia in JianZhongYuYang Tablet group was the biggest, and had extremely significant differences from the other 4 groups（P<0.01），famotidine group and gastropine group was extremely significant differences compared with gastric ulcer group（P<0.01），but famotidine group had no difference with gastropine group（P>0.05）.ConclusionTo treat gastric ulcer, JianZhongYuYang Tablet has excellent effect to relieve pain and to eliminate splenic asthenia.It has the same effect with famotidine to alleviate pain, but is better than western drugs in eliminating splenic asthenia and improving microcirculation of gastric mucosa. In mechanism of action, JianZhongYuYang Tablet can increase the mitochondrion DNA repair enzymes greatly to repair the damaged gastric mucosa, and promote the self-cure of gastric ulcer, this is the difference to western medicine. Western medicine emphasize the counteraction against harmful factors, while JianZhongYuYang Tablet focuses on self-repair, it is consistent with the theory of traditional Chinese medicine "supporting healthy energy to eliminate evils", "if healthy energy is inside, evil factors can not come in". So our research give the evidence to show the superiority of Chinese drugs. We know, the function of Chinese traditional patent drugs have multiplicate mechanisms to cure disease, our study proved one of the targets of Chinese traditional patent drugs how to cure gastric ulcer only, that is : Chinese traditional patent drugs can adjust mitochondrion DNA repair enzymes.With the development of molecular biology, we wish we can find more mechanisms of Chinese traditional patent drugs trough experiments in the future, and make greater contributions to the cause of investigating, developing the precious wealth-traditional Chinese medicine.
Key words:JianZhongYuYang Tablet； Gastric ulcer； Mitochondrion DNA repair enzymes
刘友章教授是广州中医药大学第一附属医院大内科主任，博士后导师，他首次提出了“脾主运化与细胞线粒体具有相关性”的理论，胃溃疡是针对胃黏膜的侵袭因素超过防御因素和修复能力的结果［1］。笔者从临床观察和动物实验两方面研究了健脾益气方药对胃溃疡胃黏膜的保护与修复作用。比较了健中愈疡片、黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃黏膜线粒体 8氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶，3甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的影响，并进行健脾益气方药与黏膜保护剂胃舒平以及H2受体拮抗剂法莫替丁对胃溃疡愈合质量的比较和评价。现报道如下。
1 临床观察部分
1.1 方法病例收集在广州中医药大学第一附属医院病房、胃镜室及内科进行。选择10例胃镜下没有胃黏膜病变的健康人为健康人组，作为比照标准，其中男性5例，女性5例，最大年龄58岁，最小年龄22岁。选择40例脾气虚型胃溃疡患者（纳入标准均按照《中药新药临床研究指导原则》），其中男性22例，女性18例，最大年龄62岁，最小年龄20岁，病程最长15年，最短3个月，随机分为胃溃疡组10例，健中愈疡片组10例、胃舒平组10例和法莫替丁组10例，各组除用药外，性别、年龄、病程等都均衡一致，没有显著差异。使用仪器为OLYMPUS CLV-u40电子胃镜，奥林巴斯公司生产。取材地址为广州中医药大学胃镜室。用药前1天晚上20时后禁食，第2天在胃镜下看准胃角，在大弯侧体窦交界上10 cm，小弯侧胃角上4 cm处各取组织2块，冷冻于－70℃的液氮罐中备用。
1.1.1 用量及给药方法健中愈疡片组：用健中愈疡片1 g/次（4片），口服，3次/d。
胃舒平组：用胃舒平片1.4 g/次（0.35 g/片×4片），4次/d口服，餐前1 h及睡前服用，压碎或咀嚼服用。
法莫替丁组：用法莫替丁胶囊，20 mg/次，2次/d，早晨及睡前口服。
实验药品：健中愈疡片由广州中医药大学第一附属医院制剂室制备，批准文号：粤药制字Z03020828，批号：050203，组成为党参、白术、黄芪、莪术、救必应、延胡索、蒲公英、白及、乌贼骨、珍珠末等，制成素片，每片250 mg(含生药7.45 g)。消炎痛（吲哚美辛）由广东华南药业有限公司生产，批准文号：国药准字H44020701，产品批号：060101。胃舒平（复方氢氧化铝片）由广东三才医药集团有限公司生产，批准文号：国药准字H44021288，产品批号：20060520。法莫替丁由广州白云山侨光制药有限公司生产，批准文号：国药准字：H44020955，产品批号：60090。
1.1.2 观察方法
3组均在服药后30 d复诊，按前述方法取材，并用PCR方法测定各组胃黏膜组织中胃黏膜线粒体 8－氧鸟嘌呤DNA糖基化酶、胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶、3－甲基腺嘌呤DNA糖基化酶的含量及进行疗效判定。
试剂盒均由著名生物工程公司如中山大学达安基因股份有限公司、广州市达辉生物技术有限公司提供，由中山大学达安基因股份有限公司及联合生物集团（中国）广州分公司生产，包括上游引物F(2管)，下游引物R（2管），Dntp,逆转录RT-buffer，逆转录酶（MMLV），Taq酶，ddH2O，阳性标准品（20管），5×定量buffe，批号：20060418。实验地址为广州市达辉生物技术有限公司205实验室属于中山大学达安科技园，所使用的实验室为卫生部医药生物工程技术研究中心，为国家发展和改革委员会2005年颁发授予的国家高技术产业化示范工程。使用仪器为ABI PRISM 7000 SDS荧光定量PCR仪，ABI prism公司生产。
1.1.3 疗效判定标准参照2001年版《中药新药临床研究指导原则》。
胃痛分级标准：见表1。表1 胃痛分级标准（略）
脾虚轻重程度分级：见表2。表2 脾虚轻重程度分级标准（了）
疗效判定标准：
临床痊愈：
①全部症状消失；
②受试对象所患西医诊断的胃溃疡，有相应的客观诊断指标证实确有显著改善；
③脾虚参考指标治疗后有明显改善。
具备①②项即可判断，③项作参考。
显效：
①症状有明显改善，即改善在2级以上（如＋＋＋变化为＋）；或个别主症改变在1级，而其它主要症状全部消失；
②受试对象所患疾病的客观诊断检查指标有所好转；
③脾虚参考指标治疗后有所好转。
①②有效项为必备，③项作参考。
①症状均有好转，改善在1级以上者，或个别主症有显著改善（如由＋＋＋变为＋）；
②受试对象所患疾病的客观诊断检查指标稳定；
③脾虚参考指标有相应好转。
无效：
症状无改善；所患疾病的各项客观检查无变化；脾虚参考指标亦无变化。
2 动物实验部分
2.1 脾虚模型的建立［2］70日龄180～220 g成熟Sprague Dawley大鼠雌雄各半随机分为5组(n=10)。按常规煎法制备小承气汤（大黄∶厚朴∶枳实＝4∶5∶3），模型组：每日灌饲小承气汤煎剂 60 g/kg（20 ml/kg），隔日半量进食，自由饮水；正常对照组：常规饲养，共15 d。
实验动物质量合格证明：NO0016901,质量检测单位：广州中医药大学实验动物中心，检测日期：20060330。许可证号：SCXK(号)2003－0001号监证字：2006A014，20060712。实验室为广州中医药大学动物实验中心的SPF级实验室，为广东省科委批准的广东省实验动物技术培训中心，通过了“211工程”子项目的验收。所用单味中药均一次性购自广州中医药大学中药房。
2.2 消炎痛皮下注射法胃溃疡造模［3］脾虚造模15 d后，大鼠禁食不禁水24 h，取消炎痛先溶解在5%的碳酸氢钠溶液中，实验时用蒸镏水稀释成0.4%的浓度。以消炎痛20 mg/kg背部皮下注射消炎痛，造成胃溃疡模型。
2.3 分组与给药A正常对照组：灌胃给予0.9%生理盐水2ml/只，18 mg/（kg·d）；B脾虚型溃疡模型组：灌胃给予生理盐水18 mg/（kg·d）；C健中愈疡片组：灌胃给予健中愈疡片5%混悬液2 ml/只，110 mg/（kg·d）；D胃舒平组：灌胃给予3.5%胃舒平2 ml/只，205 m g/（kg·d）；E法莫替丁组：灌胃给予0.06%法莫替丁2 ml/只，1.46 mg/（kg·d）。各组药物灌胃前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制为混悬液使用。实验期间常规饲养，自由饮食,处死动物前禁食24 h，但饮水自由。
2.4 用Okabe改良法进行胃黏膜损伤评分［4］将鼠胃固定于10%甲醛溶液中，20 min后沿胃大弯剪开冲洗，根据Okabe改良法测定出血病灶：先计算总溃疡（黏膜缺损）数，将溃疡最大径>1 mm 者按大溃疡计，测量其长宽径，按［（长径×宽径）/2］×л公式计算溃疡面积。最大径小于1mm 者以小溃疡计数，以两者计分总和综合评定溃疡指数，作为溃疡严重程度的指标。计分标准如下：无病变计0分，小溃疡个数在1～5个计0.5分，个数在6～20个或面积在1～5 mm2计1分，以后溃疡个数每增加20个和面积增加5 mm2计1分，进行胃黏膜损伤的定量化。
2.5 大鼠体重、悬吊实验及扭动次数［5］大鼠在实验前，脾虚造模后，健中愈疡片、胃舒平、法莫替丁灌胃后均用电子天平秤体重及用秒表测量悬吊时间，做为脾虚症状加重和改善的指标。用半小时肢体扭动次数来做为胃溃疡疼痛程度的指标。
2.6 大鼠胃黏膜微循环状态测定用中性红比色法，自尾静脉注入0.1%中性红（8 mg/kg），30 min后剪取胃黏膜，用三角架固定数码照相机，固定参数进行拍摄，然后并用Photoshop 7.0 软件的RGB比色功能将红色进行定量，然后对微循环状态进行比较，间接反应出溃疡愈合的质量。
2.7 数据处理所有数据均采用SPSS11.5 for windows统计分析软件处理，属于正态分布的计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。计数资料及等级资料采用多个独立样本的非参数检验。
2.8 结果见表3～13。表3 8－氧鸟嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表4 8－氧鸟嘌呤DNA糖基化酶各组P值比较(略)表5 胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶含量(略)表6 胸腺嘧啶乙二醇DNA糖基化酶各组P值比较(略)表7 3－甲基腺嘌呤DNA糖基化酶含量(略)表8 3－甲基腺嘌呤DNA糖基化酶各组P值比较(略)
表3～8表明，正常组线粒体DNA修复酶系列的含量很低，而胃溃疡组自我修复所以含量很高，法莫替丁由于减少了损害因素，所以反馈性地降低了修复酶含量，胃舒平只是物理保护作用，对修复酶影响不大，健中愈疡片大大提高了修复酶含量，增加了自我修复因素。
3 讨论
胃黏膜的损伤常由诸多有害因素引起［6］，诸如酸、碱、乙醇、胆盐、HP、急性失血、精神应激……等，药物对胃黏膜的损害的作用也十分常见。胃溃疡的黏膜修复，是指胃黏膜对有害因素如对食物、幽门螺杆菌感染、乙醇、酸、胆盐、非固醇类抗炎药、应激及温度（过冷、过热）等造成黏膜损伤的修复能力［6］。在Tarnawske 等第一次提出溃疡修复质量（Quality of ulcer healing，QUH）的概念后［7］，人们对溃疡修复的认识开始由研究外在修复因素转向侧重内在修复因素。溃疡修复的过程十分复杂，目前认为影响胃黏膜修复质量的因素主要有：①胃黏膜微循环的血流量；②生长因子的调控；③花生四烯酸的代谢产物的影响；④氧自由基对溃疡修复质量的影响；⑤老龄化对溃疡修复质量的影响；⑥HP对溃疡修复质量的影响；⑦抗溃疡药物的影响。但胃黏膜线粒体DNA修复酶在胃溃疡修复过程中的机制以及中药对其的调控研究还是一片空白。表9 胃痛评分(略)表10 胃痛定量P值比较(略)表11 脾虚症状变化例(略)表12 大鼠胃黏膜损伤评分、体重、悬吊时间及扭动次数(略)表13 大鼠胃黏膜微循环状态变化(略)
线粒体DNA修复系统相关酶的研究现状［8］：作为真核细胞能量中心的线粒体,拥有自己特异的遗传物质——线粒体DNA(mtDNA) 。mtDNA编码的每一个亚单位都是线粒体完成正常的氧化磷酸化过程所必需的,因此,线粒体基因组的完整性对于生物体的损伤修复十分重要。长期以来,人们一直认为线粒体中不存在DNA 的修复［9，10］ 。但近年来在线粒体提取物中却检测到了修复因子,其中大多数是参与清除DNA 中单个突变碱基的碱基切除修复途径(BER) 的酶,提示线粒体中存在DNA 修复。当前,对线粒体DNA 修复过程的理解是一个具有重要意义的课题,因为它将有助于探明线粒体DNA 的自我修复机制对溃疡愈合的意义。已经证实,线粒体DNA 修复的相关酶与负责核DNA 修复的对应物由相同的基因编码。生物体通过选择不同的转录起始位点或以不同的剪切方式产生具有线粒体靶向序列的转录物,也可以直接在翻译的时候通过选择不同翻译的起始位点生成线粒体靶向信号肽,从而使生成的蛋白质最终定位到线粒体。研究这些酶对于揭示线粒体DNA 的修复机制具有重要的意义。关于线粒体修复的研究已经形成了一个十分活跃的领域。这方面的研究,拓展了我们对线粒体DNA 损伤和自我修复认识的深度和广度。使我们不再单单从外部因素来研究胃溃疡的修复,而是从外部损伤和自身修复是否平衡的角度来重新看待这个问题。现在有必要通过实验来揭示线粒体mtDNA 修复机制在胃溃疡修复过程中的意义,并在此基础上,通过健脾益气中药对线粒体DNA 修复酶的干预,来提高胃溃疡的黏膜修复效果，并找到中药的作用靶点。
我院通过多年对消化性溃疡病的潜心研究，研制出由党参、白术、黄芪、莪术、救必应、延胡索、蒲公英、白及、乌贼骨、珍珠末等组成的健中愈疡片，每片250 mg(含生药7.46 g)。君药 党参、白术和黄芪——健脾养胃 ； 臣药海螵蛸、白及和珍珠层粉—— 抑酸护膜、敛疮愈疡 ；佐药救必应、蒲公英、延胡索和莪术 ——清热化湿、行气止痛、活血化淤；使药甘草——补益中气、调和诸药。诸药配伍，共奏健脾养胃、敛疮愈疡、清热解毒、行气止痛之效。
健脾益气是中医药治疗胃黏膜损伤的主要治则：中医理论认为，“脾主运化水谷之精，以生养肌肉”“四季脾旺不受邪”“正气存内，邪不可干”。气是充养全身、推动和维持人体各种组织功能正常活动的动力，包含着先天之元气、自然清气与水谷化生的精气。“气为血帅”，气血运行于全身，周流不息，外而充养皮肉筋骨，内可灌溉五脏六腑，濡养全身。而脾主运化，为气血生化之源，“后天之本”。胃黏膜保护和修复的过程，必赖旺盛的气血才能肌肉续接，黏膜再生。若脾虚气弱，则五脏六腑都将失去濡养，从而出现功能异常，影响修复进行。《脾胃论·脾胃盛衰论》曰：“百病皆由脾胃衰而生也。”临床凡修复缓慢者，大都因气虚血少，不能濡养创伤部位，致使黏膜创面正气不足，既无力抗邪，又不能滋养创面，修复缺损。《素问·萎论》曰：“脾主身之肌肉”，故治疗胃黏膜损伤，必赖补充脾胃之气，使气血生化旺盛则创面易于修复。健脾益气是中医治疗胃黏膜损伤的核心治则，是中医认识、诊治黏膜修复的突出特色之一。线粒体DNA修复系统相关酶和临床疗效的观察主要反映了不同药物的作用机制、作用靶点和效果，大鼠体重、悬吊时间测定主要用于脾虚症轻重的定量，而大鼠扭动次数主要用于疼痛程度的衡量。脾在体合肌肉、主四肢，《素问·萎论》说：“脾主身之肌肉”，四肢的营养输送，全赖于清阳的升腾宣发，故《素问·阴阳应象大论》说：“清阳实四肢。”脾气健运，则四肢的营养充足，而活动也轻劲有力，若脾失健运，则四肢的营养不足，可见怠倦无力，甚或萎弱不用。所以我们把大鼠的体重变化和悬吊时间变化做为脾虚证的检测指标。在症状方面我们用大鼠每分钟肢体扭动次数来做为胃溃疡疼痛程度的指标。大鼠胃溃疡指数是直接观察胃溃疡的愈合质量。而胃黏膜微循环状态则间接反应胃溃疡的愈合质量，胃黏膜微循环血流量对溃疡愈合质量起着关键性的作用。
通过实验最后得出结论：健中愈疡片治疗胃溃疡的机理之一是提高了线粒体DNA修复酶的含量，类似于提高了“正气”，使机体自身的修复得以提高，而法莫替丁和胃舒平对线粒体DNA修复酶的影响不大，它们主要是减少胃酸分泌造成的损害因素以及进行物理性的保护，中药和它们作用的靶点有差异。对改善胃痛症状来说，法莫替丁作用最强，健中愈疡片其次，胃舒平又次之；而对于改善脾虚症状，则健中愈疡片最强，法莫替丁和胃舒平较差。总之，本课题明确了健中愈疡片对胃溃疡线粒体DNA修复酶的调控机制，找到了健脾益气中药治疗胃溃疡的作用靶点之一，证明了中药改善症状的优越性，为今后进一步研究打下了基础。
本文承蒙刘友章教授的指导，谨致谢意！
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