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       【摘要】 
       目的 探讨内障丸对抗精子抗体阳性大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响。方法将Wistar 雌性成年大鼠随机分为6组。中药低剂量组（内障丸）、中药高剂量组（内障丸）、中药对照组（六味地黄丸）、西药对照组（醋酸泼尼松片）、模型组、空白组。从第1次免疫后1周开始给药，连续3周。之后检测内障丸对妊娠第3天大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响。结果内障丸可明显提高大鼠交配后第3天子宫一氧化氮合酶表达，提高大鼠的窝产仔鼠数。结论 内障丸能改善子宫内环境，有利于受精卵着床。
       【关键词】  内障丸 抗精子抗体 一氧化氮合酶
       Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of iNOS in uterus of antisperm antibody rats treated by NeiZhang pill.MethodsMaturate femal wistar rats were randomly divided into 6 groups:NeiZhang pill low dose group;NeiZhang pill high dose group;Liuweidihuang pill control group;Prednisone control group;model group;normal group.Therapy began after the first immune and the expression of iNOS was measured after 3 weeks" therapy.ResultsNeiZhang pill could promote the expression of iNOS in uterus and enhance the fetiferous number.ConclusionNeiZhang pill can improve internal uterus environment,facilitate fertilization and implantation.
       Key words：NeiZhang pills;  Antisperm antibody;  iNOS
        抗精子抗体（AsAb）阳性不孕约占不孕患者的20%～30%，具有较高的发病率。AsAb可以通过不同的环节影响生殖过程导致不孕和流产。本实验通过观察内障丸对AsAb阳性大鼠受孕后子宫一氧化氮合酶（iNOS）的影响，探讨内障丸对子宫iNOS的作用机制。为中药治疗AsAb阳性流产及不孕提供理论依据。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物
        
       Wistar 雌性成年大鼠，体重（180±10）g,鼠龄10周，成年雄性Wistar大鼠，体重（250±20）g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
       1.1.2  药物
       内障丸，6 g/袋，黑龙江中医药附属第一医院制剂室提供，批号：031016。六味地黄丸，0.2 g/丸，每丸相当于原药材3 g，吉林济邦药业有限公司产品。醋酸泼尼松片  5 mg/片，上海信谊药业有限公司产品。硫酸庆大霉素  8万u/只，批号031026，上海第一生化药业公司产品。
       1.1.3  试剂 
       鼠抗人精子抗体酶免试剂盒由北京华美生物技术公司提供，实验所需其它化学试剂耗材均由哈尔滨市医药公司化学试剂批发站提供。
       1.2  方法
       1.2.1  精子膜抗原提取
        
       取正常人精液弃精浆，PBS离心洗涤5次，混悬于含0.5%NP-40的Tris-HCl缓冲液，置4℃放置1 h。12 000 r/min离心30 min，取上清到透析袋，以PBS过夜透析，双缩脲法测蛋白浓度，-20℃保存备用。
       1.2.2  动物模型建立［1］ 
       用提取的膜抗原伴等体积弗氏完全佐剂，将二者充分研磨混匀，并加入硫酸庆大霉素10U/只。对除空白组外所有大鼠进行双侧腹股沟处多点皮下注射，每只大鼠注射原量为0.4 ml，2周后用精子膜抗原加等体积不完全佐剂，对除空白组外所有大鼠进行双侧腹股沟处多点皮下注射，进行加强免疫每只大鼠注射抗原剂量同上次。1周后，用精子膜抗原再次双侧腹股沟处皮下多点注射。空白组大鼠于相应时间于相同位置多点注射等体积生理盐水。
       1.2.3  分组及给药方法 
       将所有雌性大鼠随机分为6组，每组12只。中药低剂量组（内障丸9.72 g·kg-1·d-1），中药高剂量组（内障丸19.44  g·kg-1·d-1），中药对照组（六味地黄丸 0.8 g·kg-1·d-1），西药对照组（醋酸泼尼松片1.35 mg·kg-1·d-1），模型组、空白组（等剂量蒸馏水），从第1次免疫后1周开始给药，连续3周。
       1.2.4  交配实验 
       采血1周后，再次加强免疫1次，剂量及途径同第2次加强免疫，将雌性大鼠与正常成年雄性Wistar大鼠按3∶1比例合笼，每天上午，以消毒细棉签醮生理盐水，插入大鼠阴道旋转2周，取大鼠阴道分泌物，涂于载玻片上，行苏木素（H）伊红（E）染色。观察有无精子细胞，有精子为受孕0 d。
       1.2.5  标本取材 
       每组随机取6只大鼠，于受孕第3天，处死大鼠。取子宫4%多聚甲醛过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，正丁醇过夜，石腊包埋。免疫组织化学方法检测.
       1.2.6  统计方法 
       计量资料组间比较方差分析，组间两两比较采用t检验，t′检验，均采用SPSS11.5统计软件包处理。
       2  结果
       2.1  药物对交配后3 d大鼠子宫iNOS表达情况的影响测量采用半定量方法进行，细胞浆被染成棕黄色定为阳性结果，根据每张切片阳性反应颗粒占细胞总数比例定为：
        阴性（-）：未见阳性颗粒。
        弱阳性（+）：阳性颗粒少于1/3。
        阳性（++）：阳性颗粒小于2/3且大于1/3。
        强阳性（+++）：阳性颗粒大于2/3。
        为进行定量统计描述，分别对结果评分为（-）：1分；（+）：2分；（++）：3分；（+++）：4分。每张切片计数3个视野，结果见表1。表1  药物对交配后3 d大鼠子宫iNOS表达情况的影响(略)
        由表1可见，模型组大鼠iNOS表达低于空白组（P<0.01），高于醋酸泼尼松组（P<0.05），内障丸可以提高子宫iNOS的表达，经统计学处理无差异（P>0.05），六味地黄丸组iNOS的表达明显低于空白组（P<0.05）。
       2.2  药物对大鼠窝产仔鼠数的影响结果见表2。表2  药物对大鼠窝产仔鼠数的影响(略)
        由表2可见，模型组大鼠窝产仔鼠数明显低于空白组，药物组大鼠产仔鼠数有不同程度的提高，内障丸低剂量组大鼠显著高于模型组（P<0.01），六味地黄丸组窝产仔鼠数与模型组比无明显差异（P>0.05），内障丸高剂量组窝产仔鼠数与醋酸泼尼松组比无明显差异（P>0.05），与空白组比无差异（P>0.05）。
       3  讨论
        采用内障丸治疗AsAb阳性不孕及流产，实验结果表明内障丸可以提高大鼠子宫iNOS表达，并提高大鼠的窝产仔鼠数，提示内障丸对AsAb阳性不孕及流产有一定的预防和治疗作用。祖国医学认为“肾为先天之本，元气之根”，肾主藏精，精能化气，肾精所化之气，即为肾气。肾精的盛衰，不仅关系到能否受孕，而且始终影响整个孕期。若肾气亏损，便不能固摄胎元而致流产。 故肾虚是本病的主要原因，也是治疗时需要解决的首要问题。 内障丸是我院自制中成药，方中由海马、鹿茸、熟地黄、枸杞子、山萸肉、人参等组成［2］。全方既补肾阴亦补肾阳，使阳生阴长，阴阳平衡，正如《景岳全书·妇人规》指出：“善治阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善治阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而源泉不断。”从而使肾中精气旺盛，阴阳平衡，冲任调和以成胎孕。
        催化内源性NO生物合成的酶是一氧化氮合酶(NOS),iNOS是诱导型NOS。NO/NOS系统参与女性生殖生理活动,如子宫内膜周期性变化的调节、细胞凋亡、卵泡发育［3］、卵巢性激素的分泌［4］、胚胎着床、维持妊娠［5］与分娩以及平滑肌的增殖分化等。其中以iNOS在子宫内膜的表达较显著,功能也较重要［6］。NO参与雌激素启动胚胎着床的信号通路［7］；NO合成阻滞可能导致胎盘血管形成障碍,从而引发胎盘浅表着床［8］。NO在胎盘组织中可通过MMP－9的活性参与胎盘结构和功能调节［9］。
        本研究表明模型组大鼠在妊娠第3天时子宫内iNOS表达比正常对照组明显减少，偶见阳性细胞，而正常对照组大鼠的子宫中则有大量iNOS分布，妊娠第3天正处于大鼠胚胎植入前，此时子宫正在为迎接胚胎做着积极的准备，子宫中iNOS的表达对此具有重要意义。iNOS表达减少会引起NO的产量降低，从而可能影响大鼠胚胎的发育和着床，导致妊娠失败，这可能是AsAb阳性大鼠生育能力下降的原因之一。中药内障丸可以明显提高子宫内iNOS的表达，醋酸泼尼松组iNOS表达也较少，甚至找不到阳性细胞。这可能因为地塞米松可以通过抑制iNOSmRNA的转录实现对iNOS的抑制作用［3，10］，糖皮质激素［4］还可以阻止细胞因子诱导细胞内iNOS的合成。所以本研究中醋酸泼尼松可能有抑制iNOS的作用，导致iNOS较少，从而对大鼠的生殖功能产生不利影响。
        围着床期，子宫内环境出现适应性变化，使胚泡的发育与子宫内膜组织的分化同步，以利于着床。我们研究发现，模型组大鼠的iNOS表达低于正常组，说明AsAb阳性大鼠胚胎着床期，子宫内免疫环境紊乱，不利于孕卵着床，所以，模型组大鼠胚胎数较少，内障丸高剂量组大鼠子宫iNOS的表达情况与正常组相近，有利于孕卵着床，窝产仔鼠数也较理想。本实验通过测定AsAb阳性大鼠子宫iNOS的表达及内障丸对其的影响，探讨iNOS与AsAb阳性不孕及流产的关系，提示内障丸可以提高妊娠子宫iNOS表达，进而改善子宫内环境，从而达到提高生育能力、防止流产的治疗目的。
       【参考文献】
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