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       【摘要】 
       目的通过测定不同炮制程度的乌梅炭品的柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸等4种有机酸含量，确定比较具有专属性的标准炭有机酸含量与生品有机酸含量的比值。方法采用高效液相色谱法测定不同炮制程度的乌梅炭品的柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸等4种有机酸含量，比较具有专属性的标准炭有机酸含量与生品有机酸含量的比值。结果乌梅标准炭的有机酸含量大约占该生品含量的34%～37%。结论随着乌梅炒制时间的增加，炭品的有机酸含量呈明显的递减趋势。
       【关键词】  乌梅炭品 炮制 高效液相色谱法
       Abstract:ObjectiveTo determine the four kinds of organic acid contents of the Mume carbon and confirm the specific ratio in the article organic acid content between the standard carbon organic acid content and the crude.MethodsThe four kinds of organic acid contents of the Mume carbon were determined by HPLC,and the specific ratio in the article organic acid content between the standard carbon organic acid content and the crude was calculated.Results The proporation of organic acid content of Mume standards in the content of the crude goods was 34%～37%. Conclusion Along with the increase of fried time, the trend of the organic acid content of goods to the downward trend is obvious.
       Key words:Mume carbon；  Manufacture mechanism；  HPLC
        乌梅为一传统的收敛固涩药，始载于《神农本草经》，列为中品，由蔷薇科植物梅Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc. 干燥近成熟果实经熏制或烘制等方法加工而成［1］。乌梅炒制成炭药具有收敛、止血、祛淤等功效［2］。古人有“烧灰诸黑药，皆能止血”及“红见黑则止”的说法［3～4］，强调了乌梅经煅炭后可以增强药物吸附，收敛止血的作用。乌梅生品以酸味著称，含有大量有机酸，经煅炭乌梅中的有机酸含量会发生变化，对乌梅的疗效也会有一定的影响。本实验结合《中国药典》（2005年版）关于乌梅的记载以及文献中关于乌梅中成分的化学研究和药理研究，筛选出临床应用较多的柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸，采用高效液相色谱法（HPLC）测定不同炮制程度的乌梅炭品的柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸等4种有机酸含量，确定比较具有专属性的标准炭有机酸含量与生品有机酸含量的比值。为乌梅炮制工艺的研究提供可靠的依据。
       1  仪器和试药
        实验用乌梅药材为福建产生品乌梅，经鉴定为蔷薇科植物梅prunus mume的干燥果实；非接触式远红外测温仪；秒表；DGF30022B型电热干燥箱（重庆银河试验仪器有限公司）；炒药锅；节拍器（广州白云区龙归电子厂）；家用煤气灶；电子天平Sartorius BS 1105S，电子秤TCS-2000A(武汉自动化仪表厂)。
       2  方法与结果
       2.1  样品的制备称取已净制干燥的乌梅约200g，武火将铁锅加热，锅底温度升至100℃时投药，以60次/min的频率翻炒。温度升至235℃时开始计时，并取出约15粒乌梅，表示为炭品1；炒至第3分钟时取出15粒乌梅表示为炭品2，同时记录锅底温度T2；此后每隔60秒取出约15粒乌梅同时记录锅底温度，依次表示为炭品3，T3；炭品4，T4；……炭品10，T10。按照上述方法制了第2批和第3批乌梅炭，所有炭品放凉后，密封，置于干燥器中保存［5，6］。根据乌梅生品炒制的批次和取样时间，将第1批炒制的乌梅炭依次编号20050101，20050102，20050103……20050110；第2批炒制的乌梅炭依次编号20050201，20050202，20050203……20050210；第3批炒制的乌梅炭依次编号20050301，20050302，20050303……20050310。乌梅生品炒制的批次和取样时间见表1。表1  乌梅炒制时间-锅底温度测定结果（略）
       2.2  乌梅生品和炭品中的有机酸含量测定
       2.2.1  高效液相色谱法测定乌梅生品和炭品中柠檬酸和苹果酸含量色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS2 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为0.5%NH4H2PO4水溶液，用磷酸调pH至2.8；流速0.6 ml/min;检测波长214 nm；柱温25℃；进样量20 μl。流动相、对照品和样品溶液使用前均经过0.45 μm的滤膜过滤［7］。
       
       供试品溶液的制备：精密称取乌梅生品、样品号20050202的乌梅轻炭、样品号20050204的乌梅次轻炭、样品号20050206的乌梅标准炭、样品号20050208的乌梅次重炭和样品号20050210的乌梅重炭细粉各约0.25 g，置50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml后，称定重量，超声提取1 h，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1ml,挥干甲醇后，用0.5%磷酸二氢胺水溶液的流动相定容至10 ml瓶中，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得测定柠檬酸含量的乌梅生品及炭品的供试品溶液。精密称取乌梅生品、样品号20050202的乌梅轻炭、样品号20050204的乌梅次轻炭、样品号20050206的乌梅标准炭、样品号20050208的乌梅次重炭和样品号20050210的乌梅重炭细粉各约0.25 g，置50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml后，称定重量，超声提取1 h，冷却至室温，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 ml,挥干甲醇后，用0.5%磷酸二氢胺水溶液的流动相定容至10 ml量瓶中，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得测定苹果酸含量的乌梅生品及炭品的供试品溶液。
        供试品的测定：分别取测定柠檬酸含量的6个供试品溶液，进样20μl，平行测定3次。结果见表2。表2  乌梅生品及炭品中柠檬酸的含量测定结果（略）
        分别取测定苹果酸含量的6个供试品溶液，进样20μl，平行测定3次。结果见表3。表3  乌梅生品及炭品中苹果酸的含量测定结果（略）
       2.2.2  高效液相色谱法测定乌梅生品和炭品中齐墩果酸和熊果酸含量色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS2 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-0.2%乙酸铵（84∶16）；流速1 ml/min;检测波长214 nm；柱温25℃；进样量20 μl。流动相、对照品和样品溶液使用前均经过0.45 μm的滤膜过滤。
        供试品溶液的制备:精密称取乌梅生品、样品号20050202的乌梅轻炭、样品号20050204的乌梅次轻炭、样品号20050206的乌梅标准炭、样品号20050208的乌梅次重炭和样品号20050210的乌梅重炭细粉各各约1 g，置索氏提取器中，加乙醚100 ml，回流提取8 h，将提取液定量转移至蒸发皿中，挥干乙醚，残渣用甲醇溶解并定量转移至5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
        供试品的测定:分别取测定熊果酸、齐墩果酸含量的6个供试品溶液，进样20 μl，平行测定3次。表4  乌梅生品及炭品中熊果酸的含量测定结果（略）表5  乌梅生品及炭品中齐墩果酸的含量测定结果（略）
       2.3  方法学考察
       2.3.1  精密度实验取上述浓度为为0.344 7 mg/ml的柠檬酸对照品溶液20 μl，进样5次，测定各自的峰面积，计算得峰面积的RSD为0.73%。
        取浓度为0.339 1 mg/ml的苹果酸对照品溶液20 μl，进样5次，测定各自的峰面积，计算得峰面积的RSD为1.14%。
        取上述浓度为为0.449 0 mg/ml的熊果酸对照品溶液20 μl，进样5次，测定各自的峰面积，计算得峰面积的RSD为1.78%。
        取上述浓度为为0.121 0 mg/ml的齐墩果酸对照品溶液20 μl，进样5次，测定各自的峰面积，计算得峰面积的RSD为2.09%。结果见表6。表6  乌梅生品及炭品中柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸含量测定的精密度实验结果（略）
       2.3.2  重现性实验取由样品号20050206的标准炭细粉制备的各个供试品溶液，按照2.1和2.2项下操作，进样5次，测定各自的峰面积，计算得到RSD为1.21%～1.92%。结果见表7。表7  样品号20050206的标准炭的柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸含量测定重现性实验结果（略）
       2.3.3  回收率实验取样品号20050206的标准炭细粉约0.25 g，分别精密加入适量经五氧化二磷干燥至恒重的柠檬酸对照品和苹果酸对照品；另取样品号20050206的标准炭细粉约1 g，分别精密加入适量经五氧化二磷干燥至恒重的熊果酸对照品和齐墩果酸对照品，按照2.2.1和2.2.2项下操作，进样5次，测定各自的峰面积，计算得到RSD为1.31～2.03%。结果见表8～9。表8  样品号20050206的标准炭的柠檬酸、苹果酸含量测定加样回收率实验结果（略）表9  样品号20050206标准炭的熊果酸、齐墩果酸含量测定加样回收率（略）
       3  小结
        取柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸对照品和供试品溶液、空白对照溶液分别于紫外分光光度计在200～00 nm扫描，结果显示供试品、对照品于214 nm处有最大吸收，空白无干扰。
        预实验中尝试采用超声提取1h，熊果酸和齐墩果酸溶出率不理想。因此采用索氏提取器回流提取8h，结果两者的溶出率大大增加。
        测定熊果酸和齐墩果酸含量时，供试品的熊果酸和齐墩果酸的峰位出现同步紫移，经过几次重复实验没有明显改善。
        结合柠檬酸、苹果酸、熊果酸和齐墩果酸的物理化学性质，柠檬酸和苹果酸水溶性良好，极性比较强，熔点相对比较低，当乌梅在炒制过程中受到均匀的加热，柠檬酸和苹果酸的含量急剧下降，尤其是乌梅在炒制成重炭以后就很难用高效液相色谱法测出苹果酸含量。而熊果酸和齐墩果酸五环三萜类化合物易溶于氯仿等有机溶剂，熔点在300℃左右，当乌梅在炒制过程中受到均匀的加热，熊果酸和齐墩果酸的含量下降相对比较缓慢，但由于乌梅生品中齐墩果酸的含量仅为0.2%左右，加之乌梅在炒制成重炭时高温对齐墩果酸的破坏，在乌梅重炭用高效液相色谱法几乎测不出齐墩果酸的含量。
       【参考文献】
         　　［1］江苏新医学院．中药大辞典，第2版［M］.北京：中国中医药出版社，1986：464．
       
       ［2］于冰露．中药炭化炮制及应用机理研究［M］.北京：山东生物医学工程,2001,20(11)：43.
       
       ［3］赵学敏．本草纲目拾遗［M］.北京：人民卫生出版社，1963：632．
       
       ［4］牛序莉，张学兰．炒炭对乌梅成分及凝血作用的影响［J］.山东中医杂志，1997,16（5）：219．
       
       ［5］陈家春，李志雄，毛维伦．中药炭药显微定量［J］. 中国医院药学杂志，2000，20(9)：536.
       
       ［6］叶定江．中药炮制学［J］.上海：上海科学技术出版社，1996：101．
       
       ［7］毛维伦，许腊英，陈 曙，等.5种炭药存性标准的薄层研究［J］.湖北中医学院学报，2001，3(1)：41.