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       【摘要】 
       目的研究西黄丸抑瘤作用对肿瘤细胞周期的影响。方法采用体内体外两方面实验进行。体外实验：将西黄丸浸提液加入人原发性肝癌细胞株SMMC7721培养基中，72 h后流式细胞术测定SMMC7721细胞的细胞周期；体内实验：连续10 d给予移植性U14荷瘤小鼠模型西黄丸，10 d后流式细胞术测定U14细胞的细胞周期。结果在体外实验中，西黄丸（200 μl/ml）使SMMC7721中G0-G1期细胞比例显著低于肿瘤细胞对照组，G2-M期增多；在体内实验中，西黄丸高剂量组（0.96 g/kg）中也导致U14细胞G0-G1期细胞比例显著低于模型组，G2-M期细胞增多。结论 体内、体外研究结果显示西黄丸可特异性地将肿瘤细胞阻滞在G2-M期，提示西黄丸可以通过影响肿瘤细胞周期来发挥抑瘤效应。
       【关键词】  西黄丸 抗肿瘤 细胞周期
       AbstractObjectiveTo study the antitumous effect of Xihuang Pill on cell cycles of cancer cells. MethodsLeachate of Xihuang pill was used to treat human malignant tumor cell strains（SMMC7721）in vitro, after 48 hours the cycle of tumor cells was determined by flow cytometry. At the same time, Xihuang pill was used to treat tumor-bearing mice (U14) for 10 days in vivo, the cycle of  U14 cells was determined by flow cytometry. ResultsExperiment in vitro showed that the proportion of G2-M of SMMC7721 treated by leachate of Xihuang pill was high (P<0.01), and experiment in vivo showed that the proportion of G2-M of U14being treated by Xihuang pill was high too (P<0.01).ConclusionXihuang pill can block the tumor cells in G2-M stage. This indicates that Xihuang pill can affect the cycle of cancer cells so as to block cancer growth.
       Key wordsXihuang pillt；  Antitumous effect；   Cell cycle
        西黄丸为中药抗癌名方，功效活血化淤、清热解毒、消肿止痛。临床文献报道，西黄丸用于乳腺癌、肝癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗，取得了肯定的疗效。在既往的研究中发现，西黄丸可抑制肿瘤细胞的生长。为了进一步研究西黄丸抑瘤的特点，笔者采用体外、体内实验的方法，考察了它对肿瘤细胞周期的影响，具体实验如下。
       1  材料
       1.1  药物西黄丸，九寨沟天然药物集团有限公司生产，批号030501。体外实验采用西黄丸低温浸提液，体内实验采用西黄丸混悬液进行。西黄丸低温浸提液制备方法：采用密闭容器，以预冷4℃的RPMI-1640培养液浸泡西黄丸24 h（比例为0.1 g/ml），超声振荡助溶2h，复以4℃下继续浸泡48 h后取上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤后，得到西黄丸低温浸体液。实验时用RPMI-1640培养液稀释至所需浓度使用。
       1.2  试剂
       RPMI Medium 1640培养基Gibco公司，批号1165062；胰蛋白酶（Trypsin，1：250）Serva公司，批号27043C； RNA酶（RNase）Roche公司，批号90436528；新生小牛血清(Newborn Bovine Serum,NBS)三利生物制品厂，批号20040101；碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）Sigma公司，广州展晨生物科技有限公司进口分装。
       1.3  细胞株　
       人原发性肝癌细胞株SMMC7721，由成都中医药大学病理教研室提供。细胞株用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基培养，细胞贴壁达80%时传代。
       1.4  动物 
       昆明种小鼠，雌性，18～22 g，成都中医药大学实验动物中心提供，批号SCXK（川）2004-11。
       1.5  仪器Beckman Coulter Epic XL 流式细胞分析仪；Heraeus BiofugeStratos低温离心机。
       2  方法
       2.1  体外实验
       2.1.1  分组 
       体外实验分对照组（含人肿瘤细胞）、实验组(含人肿瘤细胞和西黄丸浸提液，设两个浓度100，200 μl/ml）。
       2.1.2  方法 
       取对数生长期的SMMC7721，0.25%胰蛋白酶消化，计数细胞，用1640培养基稀释成5×105/ml浓度的单细胞悬液，然后取每孔1 000 μl，接种到6孔板上，置37 ℃,5 %CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养6 h待细胞贴壁后，设对照组、实验组，均设4复孔。对照组用等体积1640培养液代替受试药物，实验组加入不同浓度的药物，每孔200 μl。6孔板置37 ℃,5 %CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养72  h后。弃培养液，收集6孔板内的细胞，PBS洗涤离心后，70%乙醇固定12 h，去乙醇，经PBS洗涤2次，加PI染剂混匀，置4℃冰箱避光染色30 min后，上机检测细胞周期，每次测定10 000个细胞。
       2.2   体内实验
       2.2.1  小鼠移植性恶性肿瘤细胞株
       小鼠宫颈癌U14由成都中医药大学病理教研室提供。
       2.2.2  小鼠移植性肿瘤的接种与传代 
       根据文献方法［1，2］将液氮冻存昆明小鼠子宫颈癌瘤株进行复苏，经体外培养增殖，生长稳定后以5×106细胞量接种于昆明小鼠腹腔内，待其长出癌性腹水后传代培养至5代，取小鼠无血性的癌性腹水，供接种使用。实验时将第5代的肿瘤小鼠癌性腹水用无菌生理盐水调整细胞数至5×106，接种于昆明种小鼠右侧腋窝皮下（每只皮下注射0.1 ml），建立移植性U14荷瘤小鼠模型。
       2.2.3  动物分组 
       实验时取昆明种小鼠30只，按体重分层随机分为3组，每组10只动物，分模型对照组、西黄丸高剂量组、西黄丸低剂量组。各组均使用移植性荷瘤小鼠。
       2.2.4  给药及实验方法 
       模型对照组给予等体积蒸馏水灌胃；西黄丸低剂量组给予西黄丸混悬液0.48 g/kg灌胃给药（西黄丸每日人用量6 g,以50 kg为正常人体重计算，给药量相当于人用量9倍）、西黄丸高剂量组给予西黄丸混悬液0.96 g/kg灌胃给药（给药量相当于人每日用量18倍）1次/d，于动物接种后1 d开始给药。连续给药10 d，处死动物，剥离皮下瘤块，在PBS中用眼科剪将瘤块剪碎后，经300目筛过滤除去成团细胞，离心800 r/min，5 min，取上层液体，经1 500 r/min离心10 min，弃上清，离心后得的细胞，再次经PBS洗涤1次后， 70%的乙醇固定24 h。去乙醇，经PBS洗涤2次，加PI染剂混匀，置4℃冰箱避光染色30min后，上机检测细胞周期，每次测定10 000个细胞。
       2.3  统计学方法 
       用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包PEMS3.1进行。
       3  结果
        见表1～2。表1  西黄丸对SMMC7721细胞周期（72h）的影响（体外）(略)
        表1可见，与肿瘤细胞对照组相比,西黄丸浸提液100，200 μl/ml使G0-G1期细胞明显减少(P＜0.01)；西黄丸浸提液200 μl/ml G2-M期细胞比例明显增高(P＜0.01)。
        表2可见,与模型组相比,西黄丸高剂量组使G0-G1期细胞明显减少（P<0.01）, G2-M期细胞明显增高（P<0.01）。表2   西黄丸对U14细胞周期（10d）的影响（体内）(略)
       4  讨论
        西黄丸出自清代王洪绪所著的《外科全生集》,为治疗“乳岩”之家传秘方，由牛黄、麝香、乳香、没药4味中药组成，方中牛黄别名犀黄，牛黄产于西北者，又叫西黄，故西黄丸也称犀黄丸。其主要功效为活血化淤、清热解毒、消肿止痛。它组方简单，疗效确切，临床应用广泛，为中医抗癌名方。目前较多的临床研究报道：西黄丸用于肝癌、乳腺癌、白血病、肺癌等恶性肿瘤的治疗，取得了肯定的疗效。既往的研究发现，西黄丸对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，但抑制作用发生的细胞周期环节是本次研究的焦点，故我们采用体内、体外两方面的实验，对此环节进行了研究。
        细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束的一个周期称为细胞周期。增殖型细胞的细胞周期分为4期,即G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期 (DNA合成后期)、M期(有丝分裂期)。有时细胞长期处于静止的非增殖状态，常称为G0期［3，4］。流式细胞技术(Flow Cytometer, FCM)是细胞周期研究中常用手段，能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析。具有速度快、精确度高、准确性好的特点，是目前最先进的细胞定量分析技术。
        在既往的文献中，有报道显示［5，6］，抗癌中药的作用是将肿瘤细胞阻止于G0-G1，使肿瘤细胞处于相对静止状态而发挥抑瘤作用。
        但本次体内、体外实验结果显示，未经药物治疗的SMMC7721，U14肿瘤细胞的细胞群主体分布于DNA合成静止的G0-G1期,这类细胞对药物往往不敏感［7～10］。在体外实验中，西黄丸（200 μl/ml）使SMMC7721中G0-G1期细胞比例显著低于肿瘤细胞对照组，G2-M期增多（P<0.01）；在体内实验中，西黄丸高剂量组（0.96 g/kg）中U14细胞G0-G1期细胞比例显著低于模型，G2-M期增多（P<0.01）；体内和体外实验的这一共同现象，提示西黄丸可能具有特异性地将肿瘤细胞阻滞在G2-M期的作用，推测西黄丸可能具有使处于G0-G1期对药物不敏感的肿瘤细胞进入增殖周期，并将其阻滞在G2-M期，其具体作用环节还需进一步研究。
        综上所述，本次研究表明西黄丸可特异性地将肿瘤细胞阻滞在G2-M期，证实西黄丸可以通过影响肿瘤细胞周期来发挥抑瘤效应。