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       【摘要】 
       目的研究银杏叶多糖的提取纯化及含量测定。方法通过对不同的提取次数、固液比及提取时间等实验，以及对粗多糖纯化的研究，确立各因素条件，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。结果各因素条件为浸提温度80℃，提取时间3 h，固液比1∶30，提取2次，用活性炭纯化。由此得银杏叶中粗多糖的得率为12.2%，纯化后的多糖得率为9.8%。测定提取的粗多糖中多糖含量为35.7%，纯化后的多糖含量为43.3%，多糖含量测定相对标准偏差小于3.0%。结论该方法纯化效果好，测定重现性好，得出银杏叶中多糖含量为4.3%。
       【关键词】  银杏叶 多糖 提取 纯化 多糖测定
       Abstract:ObjectiveThe extraction and purification methods for polysaccharide in Gingko leaves were studied and the content of polysaccharide in it was determined.MethodsThe condition of each factor for extraction and pruification from the leaves of Gingko was established through the experiments of extraction times, different ratios of material to extraction solvent and extraction time.The method of phenol-sulfuric acid was applied to determination of the content of the polysaccharide.ResultsThe conditions of the factors were extraction temperature 80℃，extraction time 3h,material to extraction solvent 1:30 ,extraction 2 times and activated carbon for purification.Raw polysaccharide in gingko leaves was 12.2%,the polysaccharide after prurified was 9.8%, the content of polysaccharide in the raw polysaccharide was 35.67%,and in the pure one was 43.32%,ConclusionThe purification method is efficient and stable. The content of polysaccharide in gingko leaves is 4.3%.
       Key words:Ginkgo leaves；  Polysaccharide；  Extraction；  Purification；  Determination of polysaccharide
       多糖又称多聚糖（polysaccharide），是构成生命活动的四大基本物质之一，不仅是机体主要供能物质，同时还具有多种多样的生物学功能，在生命活动中参与了细胞的各种活动。目前人们所知活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效［1～5］，其作用日益受到人们的重视。
        银杏 (Ginkgo) 是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，素有“活化石”之称。中国是银杏的发源地，其资源占世界总量的70%左右［6，7］。目前，银杏叶制剂已从单纯的药用逐步应用到食品饮料、保健品等行业，含银杏叶提取物的护发、生发、护肤等化妆品的开发也取得一定的进展。银杏叶内含有具有重要生理和药理活性作用的功能活性成分，但关于银杏叶中多糖的研究目前报道甚少，原因在于人们把精力都集中在了银杏叶中黄酮类物质的研究上［7～12］，而忽略了多糖。本实验对银杏叶中多糖提取的影响因素、纯化进行了一系列的研究，确定了提取纯化条件。同时对提取、纯化的多糖含量进行了测定，确定了银杏叶中多糖含量。这对于银杏叶的综合开发利用具有重要意义。
       1  材料与方法
       1.1  仪器与试剂恒温水浴，离心机，恒温干燥箱，真空干燥箱，紫外-可见分光光度计。
        95%乙醇，无水乙醇，三氯甲烷均为分析纯；葡萄糖为生化试剂。
       1.2  试样来源及预处理所用银杏叶样品，于200511采自大连民族学院校园内。将采得的银杏叶用自来水洗净，然后用蒸馏水清洗，淋干水后，用70℃恒温干燥箱烘干。
       1.3  提取、纯化方法银杏叶多糖提取、纯化步骤如下：
        a)银杏叶处理：实验前用70℃恒温干燥箱将银杏叶再烘1次，然后用高速粉碎机粉碎，过80目筛，置于棕色瓶中保存。
        b) 恒温提取：按一定固液比加水，在恒温水浴中恒温提取。
        c) 离心：提取后用离心机以5 000 r/min离心20 min，收集上清液，残渣同前再提取1次，合并两次上清液。
        d) 纯化：离心后得到的上清液，用活性炭纯化。
        e) 浓缩：用真空干燥箱对纯化后的离心液进行浓缩。
        f) 醇沉淀：加入5倍体积的95%乙醇，放入冰箱内静置24 h。
        g) 离心：对醇沉的白色絮状多糖沉淀进行离心。
        h) 洗涤：得到的多糖用无水乙醇和三氯甲烷依次清洗后放入小烧杯中，在水浴锅中蒸干后，放入80℃烘箱中干燥。
       2  结果与结论
       2.1  多糖提取影响因子实验
       2.1.1  固液比对粗多糖得率的影响取5份5 g银杏叶样品分别放置于250 ml具塞三角瓶中，按固液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50分别加入50，100，150，200，250 ml的蒸馏水，pH 7，在80℃水浴中提取3 h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置24 h后再离心，粗多糖得率见图1。
        由图1可见，固液比越大越好，但要进行2次提取，因此，固液比不要太大。由图1可以看出，固液比达到1∶30以后，粗多糖得率增加缓慢。固液比为1∶30时，粗多糖得率为10.4%，固液比为1∶40时粗多糖得率为10.5%，仅增加0.1%；固液比为1∶45时，粗多糖得率为10.7%，比固液比为1∶40增加0.2%，比固液比为1∶30增加0.3%。而固液比为1∶20时，粗多糖得率为9.4%，固液比为1∶30，比1∶20粗多糖得率增加1.0%。所以选用固液比1∶30。
       2.1.2  提取时间对粗多糖得率的影响取6份5 g银杏叶样品分别放置于250 ml具塞三角瓶中，按固液比1∶30加入蒸馏水150 ml， pH 7，在80℃水浴中分别提取0.5，1，2，3，4，5 h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置24 h后再离心，粗多糖得率见图2。
        由图2可见，蒸馏水浸提3 h后再延长浸提时间，对提取率的提高没有显著影响。当提取时间为3 h时，粗多糖得率为9.3%，提取时间为4 h时，粗多糖得率为9.6%，得率仅提高0.3%；当提取时间为5 h时，粗多糖得率为9.8%，得率比4 h提高0.2%，比3 h提高0.5%。而提取时间为3 h比2 h得率提高2.1%，所以，提取时间应以3 h为佳。
       2.1.3  提取次数对粗多糖得率的影响取1份5 g银杏叶粉末放于250 ml具塞三角瓶中，按固液比1∶30加入蒸馏水，pH 7，在80℃水浴中提取3 h，离心。收集提取离心后的残渣，按上述条件再提取2次。3次提取所得的提取液分别放置于3个三角瓶中，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置24 h后离心，粗多糖得率见图3。
        由图3可见，第1次提取粗多糖的得率最高，为9.0%；第2次次之，为2.8%；第3次仅有0.4%，所以本实验提取次数选为2次。
       2.1.4  温度对粗多糖得率的影响取5份5 g银杏叶样品分别放于250 ml具塞三角瓶中，按固液比1∶30加入pH 7的蒸馏水，分别在70，75，80，85，90℃水浴中提取3h，然后离心，浓缩，用乙醇沉淀，于冰箱内静置24 h后再离心，粗多糖得率见图4。
        由图4可见，随着提取温度的升高，多糖得率逐渐增大，在80℃达到最高，多糖得率为9.2%。但当达到85℃以后，粗多糖得率却缓慢下降。85℃时得率为9.0%，比80℃降低0.2%；90℃时得率为7.6%，比85℃降低1.4%，比80℃时降低1.6%。这是由于温度过高，多糖发生了降解，说明此时条件不利于多糖的提取，故本实验采用80℃为最佳提取温度。
        按上述条件提取得到的银杏叶中粗多糖得率为12.2%，呈棕黄色。
       2.2  银杏叶多糖的纯化研究对得到的银杏叶粗多糖提取物的精制，首先要考虑的是除去与多糖共沉淀的杂质，如黄酮等物质。由于银杏叶中含有大量的黄酮类化合物，在提取粗多糖的过程中不可避免地会与多糖发生共沉淀。黄酮溶于乙醇，所以首先考虑用乙醇来精制，同时也采用了活性炭精制的方法。
       2.2.1 未精制的粗多糖取0.100 g提取的干燥粗多糖，用蒸馏水溶解后转移于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在190～320 nm范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图5。
        由图5看出，在粗多糖提取液未经任何处理时，提取的粗多糖吸光度高达5.0。
       2.2.2  乙醇精制方法一在提取的粗多糖用乙醇沉淀24 h后，离心前用50 ml无水乙醇洗涤，然后离心。取上述方法得到的干燥粗多糖0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在190～320 nm范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图6。
        由图6可以看出，粗多糖经乙醇洗涤后，有部分杂质被去除，所以谱图6与谱图5对比在320nm附近的吸光度略有下降。
       2.2.3  乙醇精制方法二将提取的粗多糖在离心后，干燥前用50 ml无水乙醇分两次洗涤，离心。取上述方法得到的干燥粗多糖0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在190～320 nm范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图7。
        由图7可看出采用这种乙醇洗涤的方法比乙醇精制方法一效果要好一些，在255～320 nm波长范围内，吸光度有明显下降，说明这种方法要优于乙醇精制方法一。
       2.2.4  乙醇精制方法三将提取的粗多糖在离心、干燥后用60 ml蒸馏水溶解，再用乙醇沉淀，离心，干燥。取上述方法得到的多糖0.100 g，用蒸馏水溶解后转移于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在190～320 nm范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图8。
        由图8可以看出采用这种方法比前两种方法效果要好一些，在230～320 nm波长范围内，吸光度明显下降，说明这种方法要优于乙醇精制方法二，但纯化效果不是很理想。
       2.2.5  活性炭精制取5.0 g已粉碎的银杏叶按已确立的最佳提取条件在80℃水浴中提取2次，得到的提取液用活性炭精制，然后将滤液浓缩，加乙醇沉淀，得到多糖。称取提取的多糖0.1 g，用蒸馏水溶解后转移于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用紫外分光光度计在190～320 nm范围内进行扫描，得到的紫外光谱图见图9。
        由图9可以看出采用活性炭吸附的方法比用乙醇去黄酮的方法效果要好得多。在190～320 nm波长范围内，吸光度明显下降。由此确定采用活性炭吸附的方法来纯化提取的银杏叶粗多糖。
        用活性炭精制后，得到的多糖得率为9.8%，呈白色。
       2.3  银杏叶多糖含量检测本实验采用苯酚-硫酸比色法对银杏叶多糖含量进行测定。
       2.3.1  标准样品溶液、空白溶液及测定从已配制的10.0,20.0，30.0，40.0，50.0 mg/L的葡萄糖标准溶液中分别取出2.0 ml于10ml具塞试管中，再分别加入6%苯酚溶液1.0 ml，缓慢加入浓硫酸5.0 ml，摇匀。静置30 min，在490 nm波长下进行比色分析。取2.0 ml蒸馏水于10 ml具塞试管中，代替葡萄糖标准溶液，即为空白溶液，测定同标准样品的测定。标准曲线的相关系数为0.999 7。
       2.3.2  多糖样品的测定分别取4份精制多糖和粗多糖样品，用蒸馏水溶解后，分别转移至50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。从中分别取出2.0 ml于10 ml具塞试管中，按与标准样品测定相同的方法进行测定。结果见表1。表1  多糖含量测定结果（略）
       2.3.3  精密度实验对提取得到的粗多糖、精制多糖分别进行8次测定。结果见表2。表2  精密度实验结果（略）
        由表2可见， 8次测定精制多糖与粗多糖的相对标准偏差均小于3.0%，精制多糖样品中多糖含量为43.1%，粗多糖样品中多糖含量为35.1%。
       2.3.4  银杏叶中多糖含量由上述多糖含量测定得知，银杏叶中提取的粗多糖得率为12.2%，测得其中多糖含量为35.67%，由此可计算出银杏叶中多糖含量为4.35%；同理用精制的多糖计算银杏叶中多糖含量为4.25%，两种提取方法得到的多糖计算银杏叶中多糖含量的误差为2.33%。说明在用活性炭对提取的粗多糖的纯化过程中多糖基本没有损失。
       3  结论
        银杏叶多糖提取条件为80目银杏叶样品在80℃，固液比为1∶30 的pH 7.0蒸馏水中浸提3 h，提取2次，然后经离心、浓缩、醇沉等步骤得到银杏叶粗多糖。按上述条件得到的银杏叶中粗多糖得率为12.2%。
        银杏叶中粗多糖的纯化，采用活性炭效果较理想。精制后银杏叶中多糖的得率为9.8%。
        采用苯酚-硫酸比色法对银杏叶提取物中多糖含量进行测定，标准样品溶液的相关系数为0.999 7，多糖的8次测定相对标准偏差小于3.0%。测得粗多糖中多糖含量为35.67%，纯化后多糖中多糖含量为43.32%。最后计算出秋季采集的落地黄色银杏叶中多糖含量为4.3%。
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