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       【摘要】 
       目的研究滋补肾阴方药对D-半乳糖（D-gal）所致衰老小鼠自由基代谢及免疫功能的影响。方法采用D-gal复制衰老小鼠模型。测定衰老小鼠血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，胸腺指数和脾指数，脾脏T淋巴细胞增殖活性及血清中白介素-2（IL-2）水平，并观察滋补肾阴方药对上述指标的影响。结果滋补肾阴方药能明显提高血清中SOD活性，降低血清中MDA含量，并提高胸腺指数、脾指数，脾脏T淋巴细胞增殖活性和血清中IL-2水平。结论抑制脂质过氧化反应，提高抗氧化酶活性，改善免疫功能可能是滋补肾阴方药延缓衰老的作用机制之一。
       【关键词】  中医药疗法 衰老模型 自由基 免疫
       Abstract:ObjectiveTo explore the effect of  invigorating kidney-YIN recipe on the free radical metabolism and immune function of aging mice induced by D-gal.MethodsMalondialdehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) activity in serum,thymus indexes, spleen indexes, activity of T lymphocyte and the level of IL-2 were determined in aging mice induced by D-gal.The effect of invigorating kidney-YIN recipe on the above indexes was observed.ResultsThe invigorating kidney-YIN recipe could significantly increase SOD activity in serum; decrease MDA content in serum, enhance thymus indexes, spleen indexes, activity of T lymphocyte and serum IL-2 content.ConclusionTo inhibit lipid peroxidation,increase activity of antioxidase and improve immune function might be one of the mechanisms of invigorating kidney-YIN recipe against aging.
       Key words:Therapeutics of traditional medicine;  Aging model;  Free radicals;  Immune
        自由基损伤和免疫功能低下是老化的重要机制之一。目前，中医延缓衰老研究以补肾占居绝对优势，温补肾阳延衰的研究已取得了一些进展［1］，而滋补肾阴抗衰老的作用研究不多［2］。根据中医学阴阳互根，阴阳平衡的理论，补肾阴、补肾阳应该具有同等重要的作用。左归饮是中医滋补肾阴的代表名方，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓和山茱萸组成，具有延缓衰老的功效［3］，现已被用于临床治疗一些老年性疾病如冠心病、糖尿病等，效果较好。据此立滋补肾阴法作为延缓衰老治则，并观察经典方剂左归饮对D-半乳糖拟衰小鼠自由基代谢及免疫功能有关指标的影响。现将结果报告如下。
       1  材料和方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物昆明种小鼠30只，2月龄，体重为(20±2.0)g，雌雄各半，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号为SCXK（苏）2002-0018。
       1.1.2  药品左归饮，由熟地、山药、枸杞、炙甘草、茯苓、山茱萸按9∶6∶6∶3∶4∶5比例组成。以上药物一次性购于安徽芜湖健康大药房，并经鉴定。上方常规水煎3次，合并滤液浓缩至生药含量0.577 5 g/ml，高压灭菌，4℃冷藏保存备用。
       1.1.3  试剂与仪器D-半乳糖为上海试剂二厂产品。MDA、SOD测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。IL-2检测盒为晶美生物工程有限公司产品。刀豆蛋白A（ConA）、四甲基偶氮唑盐（MTT），华美生物工程公司出品。测定仪器为722分光光度计；550型酶联免疫检测仪。
       1.2  方法
       1.2.1  动物分组与给药昆明种小鼠30只，适应性喂养1周后随机分为3组，即正常对照组、模型对照组、滋补肾阴组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组每只颈背皮下注射5％D-半乳糖0.5 ml，1次/d，连用6周，造成衰老模型。正常对照组颈背皮下注射同等剂量生理盐水。造模的同时，正常对照组和模型对照组每只每天灌服生理盐水0.5 ml，滋补肾阴组按5.5 g/(kg·d)剂量灌服左归饮煎液（相当于成人剂量的10倍）。
       1.2.2  指标检测用药6周后，停药，禁食24 h，称重。无菌取脾脏和胸腺，同时摘眼球取血2 ml，3 000 r/min，离心5 min，分离血清。小鼠血清中MDA含量、SOD活性和IL-2水平测定均严格按试剂盒说明书要求进行。
        丙二醛（MDA）测定：采用硫代巴比妥酸法测定血清中MDA含量。
        超氧化物歧化酶（SOD）测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定血清中SOD活性。
        胸腺指数和脾脏指数测定：称重后计算，单位mg/g体重。
        胸腺指数（%）=胸腺重量小鼠重量×100%
        脾脏指数（%）= 脾脏重量小鼠重量×100%
        脾脏T淋巴细胞增殖活性测定：采用MTT法测定，将各组小鼠断头处死，无菌摘取脾脏。常规制备脾细胞悬液，用RPMI-1640完全营养液调浓度为5×106/ml。于96孔培养板上，每孔加入100 μl脾细胞悬液，100 μl ConA溶液（终浓度4 μg/ml），各3复孔，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养48 h，终止前4 h，每孔加MTT 10 μl，培养结束后弃上清，每孔加入0.08 mol/L盐酸异丙醇100 μl /孔，轻轻振荡后，继续孵育1 h，酶标仪测570 nm OD值。
        白介素-2（IL-2）含量测定：采用双抗体夹心ELISA法测定血清中IL-2含量。
       1.3  统计学分析实验数据的统计学处理由本人采用SPSS 10.0统计软件进行计量资料组间方差分析和q显著性检验。
       2  结果
       2.1  药物对血清中MDA含量和SOD活性的影响见表1。模型对照组血清中MDA含量明显高于正常对照组（P<0.01）、SOD活性明显低于正常对照组（P<0.01）；滋补肾阴组能明显提高模型对照组血清中SOD活性，同时降低模型对照组血清中MDA含量，差异具有显著性（P<0.01）。 表1  各组血清中MDA含量和SOD活性（略）
       2.2  药物对胸腺指数和脾指数的影响见表2。 模型对照组胸腺指数和脾指数均明显低于正常对照组（P<0.05）；滋补肾阴组胸腺指数和脾指数明显高于模型对照组（P<0.05）。表2  各组胸腺指数和脾指数（略）
       2.3  药物对T淋巴细胞活性的影响见表3。 模型对照组T淋巴细胞活性明显低于正常对照组（P<0.01）；滋补肾阴组明显高于模型对照组（P<0.01）。表3  各组T淋巴细胞活性（略）
       2.4  药物对血清中IL-2含量的影响见表4。模型对照组IL-2含量明显低于正常对照组（P<0.05）；滋补肾阴组明显高于模型对照组（P<0.05）。表4  各组血清中IL-2含量（略）
       3  讨论
        由于老龄动物难以得到和非常昂贵，本研究采用了小鼠亚急性衰老模型。其原理为小鼠长期注射D－半乳糖，引起全身代谢紊乱，以致产生各器官、系统功能衰退。此模型制作方法简便，衰老特征明显，实验费用较低，是目前国内外常用的衰老模型之一，它在研究衰老机制和抗衰老药物作用机理中应用非常广泛［4］。
        SOD和MDA是较为公认的衰老指标。本研究结果显示，拟衰小鼠血清SOD活性明显下降，MDA含量明显升高。这一结果反映D-半乳糖化使小鼠机体抗氧化酶活性下降，机体过氧化反应增强，脂质过氧化物增多，氧化与抗氧化平衡失调，提示小鼠发生了拟老化效应，造模成功；滋补肾阴方药能明显提高血清SOD活性，表明该方可以增强机体内源性抗衰老物质活性，从而抑制自由基对细胞的损害，MDA系自由基反应的最终产物，该方能使血清MDA含量降低，其作用机制可能是本方通过提高内源性抗衰老物质的活性，抑制脂质过氧化反应，或是本方具有直接清除自由基作用之故。
        免疫器官衰变最明显的是胸腺和脾，胸腺和脾重量的降低、萎缩，功能衰退可使免疫功能降低，导致老年人恶性疾病发生率增高，加速老化进程。本研究结果显示，拟衰小鼠胸腺指数、脾指数、T淋巴细胞活性及血清IL-2含量明显下降，提示胸腺和脾脏的重量明显下降，免疫器官老化，免疫因子分泌不足，免疫功能低下，进一步验证了拟老化效应；滋补肾阴方药明显提高胸腺指数、脾指数、T淋巴细胞活性及血清IL-2含量，说明该方能够有效地控制和对抗免疫器官的衰老，改善机体的免疫功能，提高抗病能力，从而对延缓衰老具有积极的意义。
        中医学认为，肾虚是衰老的主要原因。本研究结果证明，补肾阴在调节自由基代谢，提高抗氧化能力及改善免疫功能等方面，具有明显的作用，滋补肾阴方药（左归饮）是理想而有效的延缓衰老的药物。
       【参考文献】
         　　［1］付 嘉，熊 彬，郑冰生，等. 巴戟天对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化系统作用的实验研究［J］.中国老年学杂志，2004，12（24）：1206.
       
       ［2］戴薇薇，金国琴，张学礼，等. 左归丸、右归丸对老年大鼠海马、杏仁核氨基酸类和单胺类神经递质含量变化的影响［J］. 中国老年学杂志，2006，26（8）：1066.
       
       ［3］Zhang J，Cui CD，Xu Q. Effect of different prescriptions for tonifying kidney on RNA transcription activity in isolated nuclei and protein synthesis activity in Free-Cell extracts of the different organs of presenile mice［J］.Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Zazhi，1998，9(12)：550.
       
       ［4］陈 勤，胡雅儿，夏宗勤，等. 知母皂甙元对半乳糖拟痴呆模型小鼠学习记忆和脑内自由基代谢的影响［J］.中国药理和临床，2000，16（5）：14.