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       【摘要】 
       目的优选枇杷叶中三萜酸类成分的提取工艺。方法采用正交实验方法，以齐墩果酸和熊果酸的总含量以及干浸膏得率为考察指标，优选枇杷叶中三萜酸类成分的最佳提取工艺。结果在影响提取效果的因素中，影响程度大小依次为乙醇浓度>提取时间>乙醇用量。结论最佳提取工艺为分别以6倍量和4倍量的80%乙醇提取两次，1.5 h/次。
       【关键词】  枇杷叶 三萜酸类 正交实验 齐墩果酸 熊果酸
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology condition for triterpenic acids from Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.. MethodsThe optimal extraction process was selected with orthogonal test. The total content of oleanolic acid and ursolic acid and the extraction yield were used to evaluate the factor levels. ResultsThe order of factors to affect the content of oleanolic acid and ursolic acid and extraction yield was alcohol concentration > refluxed time>solvent quantity. ConclusionThe ideal process is to extract 2 times with 80% alcohol, the first with 6 times amount, the second with 4 times amount, 1.5 h each time.
       Key words：Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.;   Triterpenic acid;  Orthogonal test;  Oleanolic acid;  Ursolic acid
        枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶，别名巴叶、芦桔叶, 广泛分布于我国中南及陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、贵州、云南等地。枇杷叶是一味常用中药，其味苦、微辛，性微寒。归肺、胃经，能清肺止咳、和胃、降逆、止渴，主治肺热咳嗽、阴虚劳咳、湿疹等症［1］，收载于历版《中国药典》供中医临床使用。目前从枇杷叶中分离的化学成分主要有三萜酸类、倍半萜类、黄酮类、多酚类等成分［2］，其中三萜酸类成分有很强的药理活性。近年来的研究发现三萜酸类成分具有抗炎［3］、降血糖［4］、抗病毒［5］等活性，而其中三萜化合物主要为熊果酸、齐墩果酸以及以其为母体的衍生物。本实验以熊果酸和齐墩果酸的含量为指标，运用正交实验方法对枇杷叶中三萜酸类成分的提取工艺进行了研究。
       1  仪器与试剂
        Mettler AE240 电子天平，KQ-100DE型数控超声仪（江苏省昆山市超声仪器有限公司），Shimadzu高效液相色谱仪（LC-20A泵，SPD-20A紫外检测器）。
        齐墩果酸标准品（0709-9803）、熊果酸标准品（110742-200516）（中国药品生物制品检定所），甲醇（色谱醇），重蒸水，冰醋酸（分析纯），其他试剂均为分析纯。
        枇杷叶采购于苏州西山，由本所郭荣麟研究员鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.的干燥叶。
       2  方法与结果
       2.1  正交实验设计参考有关文献和预实验选择乙醇为溶剂，以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间为实验因素，每个因素设3个水平，进行L9(34)正交实验。结果见表1。表1  正交实验的因素和水平（略）
       2.2  干浸膏制备取干燥枇杷叶，粉碎机粉碎成粗粉，分别精密称取9份，各50.000 g。按表1选择的条件加热回流提取，合并提取液，过滤，浓缩，回收乙醇，水浴（60℃）蒸至近干，再于真空干燥箱中（60℃）干燥，干燥器中冷却0.5 h后迅速称重，粉碎，取样测含量。
       2.3  齐墩果酸和熊果酸含量测定
       2.3.1  色谱条件
       色谱柱为ArichromBond-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），检测波长210 nm，流动相为甲醇∶水∶冰醋酸（92∶8∶0.2），流速1 ml·min-1，柱温25℃。
       2.3.2  标准品溶液的配制和标准曲线的建立精密称取齐墩果酸和熊果酸标准品适量，加甲醇配成含齐墩果酸和熊果酸浓度分别为0.216 mg·ml-1和0.26 mg·ml-1的溶液。
        取标准品溶液10，12，14，16，18，20 μl，分别进样，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，标准品进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。熊果酸：Y=4.455 04×105X+1.475 6×104，r=0.999 8；齐墩果酸：Y=4.306 64×105X+2.965 8×104，r=0.999 9。 结果表明齐墩果酸在2.16～4.32μg ，熊果酸在2.6～5.2μg内线性关系良好。
       2.3.3  供试样品液的制备和测定
       精密称取提取物浸膏粉适量，至10 ml量瓶中，加甲醇约5 ml，超声提取30 min，再加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤后进样。色谱条件同上。
       2.4  数据处理及结果对正交实验结果采用综合评价方法，即以齐墩果酸和熊果酸的总含量加权系数0.6，浸膏得率加权系数0.4作为综合评价指标。综合评价分值=齐墩果酸和熊果酸的总含量×0.6+浸膏得率×0.4。结果见表2。表2  正交实验结果（略）
        方差分析结果（见表3）表明乙醇浓度、提取时间对实验结果有显著影响，其中乙醇浓度（B）影响最大，其次是提取时间（C），溶剂用量(A)影响较小。由表2直观分析综合评价R值，最佳提取工艺是A3B2C2，即80%乙醇提取两次，提取1.5 h/次，第1次加10倍量乙醇，第2次加8倍量乙醇。表3  方差分析（略）
       3  讨论
        本实验采用高效液相法测定枇杷叶提取物含量，以甲醇∶水∶冰醋酸（92∶8∶0.2）为流动相对熊果酸和齐墩果酸有良好的分离度，在预实验对枇杷叶含量测定中发现其三萜酸类成分以熊果酸和齐墩果酸含量最高，所以本实验以该两种成分含量测定为依据进行正交实验。
        本实验经正交直观分析结果表明最佳提取工艺是A3B2C2，即80%乙醇提取两次，每次提取1.5 h，第1次加10倍量乙醇，第2次加8倍量乙醇。实验中发现提取液在浓缩至醇浓度较低时会产生大量泡沫，由于乙醇用量因素无显著影响，考虑到溶剂成本及增加溶剂量给浓缩带来的不便，最终确定最佳提取工艺为A1B2C2，即80%乙醇提取两次，每次提取1.5 h，第1次加6倍量乙醇，第2次加4倍量乙醇。以最佳工艺进行验证实验，结果表明该工艺重复性和稳定性好，适于大生产。
       【参考文献】
         　　［1］国家中医药管理局，《中华本草》编委会.中华本草，第4卷［M］.上海：上海科技出版社，1999：140.
       
       ［2］沙 娜，梁敬钰. 枇杷叶研究进展［J］.海峡药学，2006，18(1): 6.
       
       ［3］Shimizu M, Fukumura H, Tsuji H, et al. Anti-flammatory constituents of topically applied crude drugs Ⅰ.Constituents and anti-inflammatory effect of Eriobotrya japonica Lindl.［J］.Chem. Pharm. Bull (Tokyo), 1986, 34(6): 2614.
       
       ［4］Noreen W., Waddod A., Hidayat HK,et al. Effect of Eriobotrya japonica on blood glucose levels of normal and alloxan-diabetic rabbits ［J］.Planta Med., 1988, 54: 196.
       
       ［5］De Tommasi N, De Simone F, Pizza C, et al. Constituents of Eriobotrya japonica. A study of their antiviral properties［J］.J. Nat. Prod, 1992, 55 (8): 1067.