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       【摘要】 
       目的优化越鞠泡腾颗粒的提取工艺。方法采用正交实验设计方法，以水为溶媒进行回流提取。采用高效液相色谱（HPLC）法测定回流提取物中栀子苷的含量，并以此作为评价指标对回流提取工艺中的溶媒用量、提取时间及提取次数进行优化。结果较优提取工艺为加入10倍量的水浸泡60 min，回流提取30 min。结论 该提取工艺比较简便，合理可行。
       【关键词】  越鞠泡腾颗粒 正交实验 提取工艺 栀子苷 高效液相色谱法
       Abstract：ObjectiveTo optimize extraction process for Yueju Effervescent Granules. MethodsThe quantity of solvents, time, and number for extraction were optimized by orthogonal design with the content of Gradenoside in the extract as the index. In the experiment, the content of Gradenoside in the extract was measured by HPLC. ResultsThe optimum extraction process that was selected by orthogonal design in this program was:the sample was soaked for 60 minutes with 10 times amount of water and extracted for 30 minutes.ConclusionThe extraction process is simple, reliable and suitable for practical use.
       Key words：Yueju Effervescent Granules；   Orthogonal design；   Extraction process；   Gradenoside；  HPLC
        越鞠方是治疗郁证的代表方剂，出自《丹溪心法》，由苍术、香附、川芎、神曲、栀子5药组成，主治气、血、痰、火、湿、食六郁，可用于胸腹痞闷，脘腹胀痛，嗳腐吞酸，恶心呕吐，饮食不消等诸症［1］。药理研究表明，5味药配伍后能有效地抑制实验动物胃溃疡的发生，并有显著的利胆、镇痛和抗炎作用［2］。目前越鞠方临床应用剂型是以生药入药的传统丸剂，药物服用量过大，溶出速度受限，生物利用度不高。基于现代人们的喜好和药物的特性，将其研制成溶解迅速、吸收快、生物利用度高及便于患者服用的口服泡腾颗粒剂剂型。本实验采用正交设计法，以栀子苷含量作为提取工艺的评价指标，对越鞠泡腾颗粒剂的提取工艺条件进行优化。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器 
       Agilent 1100高效液相色谱仪、DAD检测器、四元泵、Agilent 1100工作站；Bp211D电子分析天平（德国，sartorius）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；MYB型调温电热套（2 000 ml，天津市华北实验仪器公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）。
       1.2  试药
        
       乙腈（色谱纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市光复精细化工研究所，生产批号20051110）；磷酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；水为重蒸水，乙醇（95%食用乙醇，天津市津酒集团）；栀子苷对照品（中国药品生物制品检定所）；中药材（天津市中药饮片厂）。
       2  方法与结果
       2.1  挥发油的提取［3］ 
       
       采用水蒸气蒸馏法提取挥发油。将香附、川芎、苍术粉碎成粗粉，加10倍量水浸泡0.5 h，提取时间为6 h，得到的挥发油为淡黄色透明油状物，具有浓郁清香味。药渣和蒸馏的水溶液留存备用。
       2.2  神曲活性成分的提取 
       神曲的活性成分为酵母菌、淀粉酶等，消食化积，助消化。低浓度的乙醇不破坏神曲的活性。通过渗漉，不会因加热而使酵母失活。将神曲捣成小块，用25%乙醇适量浸泡24 h后，进行渗漉，渗漉速度为1～3 ml/4 min。每100  g神曲收集流液约400 ml。
       2.3  栀子＋提取挥发油后的药渣的提取工艺条件的筛选
       2.3.1  正交实验设计［4，5］ 
       根据预实验结果，以水作为溶剂进行回流提取，选用L9(34)表进行正交实验，以浸膏中的栀子苷含量作为评价指标，采用高效液相色谱法测定栀子苷含量优化提取工艺。结果见表1。表1  提取实验因素水平（略）
       2.3.2  提取测定液的制备 
       以原处方量比例（2倍量）称取栀子（捣破外壳）12 g，按比例加入提取挥发油后的药渣及蒸馏的水溶液，再加适量水浸泡60 min，回流提取，水提液浓缩后，加入95%的乙醇使含醇量达50%，静置过夜，过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩并定容至100 ml。精密吸取10 ml该浓缩液至蒸发皿中，水浴蒸干，得浸膏，研磨成粉。精密称取0.1 g浸膏粉，置10 ml容量瓶中，用50%甲醇超声溶解，定容，用微孔滤头（0.45 μm）过滤后测定其栀子苷含量。
       2.3.3  栀子苷含量测定方法的确定
        色谱条件［6］  ：色谱柱为依利特 C18 (4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相为乙腈-水-磷酸(9∶91∶0.1 )；检测波长240 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温20℃。
        线性范围的考察：精密称定栀子苷对照品13.49 mg，用50%甲醇溶解后，置10 ml容量瓶中，定容，摇匀。精密吸取0.3，0.7，0.9，1.4，1.9，2.3 ml对照品溶液，分别加入至5 ml容量瓶中定容，得到6组不同浓度的对照品溶液。按上述色谱条件，分别吸取每组对照品溶液20 μl进样，测定峰面积积分值（见图1）。用峰面积积分值对进样量进行回归，得线性回归方程：y＝1 229.10x＋125.97 (r＝0.999 9)，线性范围为1.62～12.42 μg。
        精密度实验：精密吸取某一浓度的对照品溶液20 μl进样，按上述色谱条件连续重复5次，记录所测定栀子苷的峰面积积分值，计算RSD值为0.78%。
        稳定性实验：取某一提取测定液，按0，2，4，8，24 h不同时间间隔进样，测定栀子苷的峰面积积分值，计算RSD值为1.14%，结果表明提取测定液中栀子苷在24 h内稳定。
        阴性对照实验：取阴性提取液（处方中缺栀子药材），按提取测定液的制备方法制备阴性测定液，进样。结果其色谱在栀子苷相应保留时间无峰出现，说明处方中其他成分对测定结果无干扰。见图2。
        提取液含量的测定：精密吸取各提取测定液20 μl，按上述色谱条件依次进样，测得栀子苷峰面积积分值（见图3），计算出各提取测定液栀子苷的含量。结果见表2。表2  提取工艺条件L9(34 )正交实验结果（略）
       2.4  结果分析
       2.4.1  极差分析 
       由表2中的R值可知，影响栀子苷含量因素的大小顺序为A＞B＞C。说明溶剂用量是重要影响因素，提取时间次之。
       2.4.2  方差分析 
       采用SAS统计软件对正交实验结果进行方差分析，结果见表3。由方差分析结果可知，因素A对栀子苷含量的影响有显著性。结合极差分析及表2计算结果，按生产实际中降低消耗，提高效率的原则，确定较优的提取工艺条件为A2B1C1，即加入10倍量的水浸泡60 min，回流提取30  min。表3  方差分析结果（略）
       2.5   较优提取工艺的验证 
       按上述较优工艺条件进行实验验证（n＝6），结果见表4。栀子苷的平均含量为46.24 mg·g-1，表明所确定的较优工艺合理可行。表4  较优提取工艺的验证结果（略）
       3  讨论
        提取挥发油时，将药材粉碎成粗粉较好。但由于香附富含淀粉，粉末太细，反而影响挥发油的提取，容易糊化，炭化，影响药效，故香附药材不能粉碎过细。
        栀子苷易溶于水和乙醇。可用水和乙醇作为溶剂进行提取。但预实验结果表明，两种溶剂的提取结果无显著性差异。从降低成本和实验可操作性出发，在提取工艺条件设计时，选择水作提取溶剂。
        为了探讨栀子苷受热的稳定性，在将提取液制备成干膏的过程中，采取了两种方法，真空干燥（70℃）和水浴干燥。预试验结果表明，两种干燥方法的栀子苷含量无显著性差异。本着高效率、低消耗的原则，在实验设计时，采用了水浴干燥方法。
        采用HPLC法进行含量测定。选择流动相时，参考有关文献［4］，通过实验摸索，结果以乙腈-水-磷酸(9∶91∶0.1 )条件下分离效果较好，杂质干扰小，栀子苷的保留时间约为20 min左右。
       【参考文献】
         　　［1］赵宇昊,王秀娟.越鞠丸方名渊源与临床加减运用［J］.北京中医药大学学报,2004,27(6)：13.
       
       ［2］周晓棉,朱 丹,曹颖林.越鞠胶囊内容物的药理作用［J］.沈阳药科大学学报,2003，20(4)：288.
       
       ［3］李 慧,王一涛.不同方法提取川芎挥发油的比较分析［J］.中国中药杂志,2003,28(4)：379.
       
       ［4］谢学建,张俊慧,马爱华.中药栀子研究进展［J］.时珍国医国药,2000,11(10)：943.
       
       ［5］王振华.桅子的提取工艺研究［J］.中药材,2001,24(4)：224.
       
       ［6］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：625.