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       【摘要】 
       目的研究薄荷油致小鼠肝毒性的量效、时效关系及自由基损伤机制。方法小鼠口服不同剂量薄荷油，测定其LD50。另取小鼠按不同剂量或不同时间点分组，检查血清ALT等肝功能指标和肝组织形态变化，测定肝组织SOD，MDA。结果小鼠口服薄荷油的LD50为3.0 ml/kg。ALT等肝功能指标在给药后24～48 h达到高峰，72 h可恢复近正常值。与正常组相比，薄荷油中、高剂量组对肝组织损伤显著，随着剂量增大，ALT等肝功能指标升高显著(P<0.05或P<0.01)。薄荷油组与正常组比较，小鼠肝组织中SOD降低而MDA升高(P<0.05)，与四氯化碳相似。结论小鼠一次性口服大剂量薄荷油可造成急性肝损伤甚至死亡，并显示有毒性时效、量效关系；自由基损伤可能是其肝毒性机制之一。
       【关键词】  薄荷油 小鼠 肝毒性 时间－剂量－毒效 机理
       Time-dose Effects and Mechanism of Peppermint Oil on Liver Damnification in Mice
       LIU Hongjie，JIN Ruomin，ZHANG Wenbin，QI Shuangyan，PANG Huifang，ZHOU Zhilan
       (Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China)
       Abstract:ObjectiveTo study the time-dose effects and free radical mechanism of peppermint oil on liver damnification in mice. MethodsThe medial lethal dose(LD50) of mice was determined when they took a different dose of peppermint oil orally. After other mice were divided into different groups according to different dose or time, hepatic functional parameters in serum were examined for example alanine aminotransferase(ALT) and so on. The morphologic change of hepatic tissues were observed, and superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) of hepatic tissues were detected .ResultsThe orally LD50 of peppermint oil was 3.0 ml/kg. Hepatic functional parameters in serum reached to the max at 24～48 hours after being intervened, which recovered close to normal values at 72 hours. Compared with that of the control group, hepatic tissues of the high and medium dose groups were damaged significantly, and hepatic functional parameters in serum advanced significantly (P<0.05 or P<0.01). SOD of hepatic tissues of mice taking peppermint oil was low and MDA of that was high compared with that of the control group, which was similar to that of carbon tetrachloride.ConclusionAcute toxicity even death may occur when mice take a large dose of peppermint oil once orally. Timedosetoxicity effects would be indicated. Free radical damnification might be one of the liver injury mechanism of peppermint oil.
       Key words:Peppermint oil;  Mouse;   Liver damnification;  Timedosetoxicity effects;   Mechanism
       薄荷油peppermint oil系从唇形科植物薄荷(Mentha hap loca lyx Briq.)中提取的挥发油，在食品、药品、护肤、洗发等领域被国内外广泛应用。国内外曾报道服用大剂量薄荷油可致中毒［1～3］ ，本实验对薄荷油致小鼠肝毒性的时效、量效关系进行了研究，并对其可能存在的自由基损伤机理进行了初步探讨。现报道如下。
       1  器材
       1.1  动物KM小鼠，清洁级，雌雄各半，（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)20030003。
       1.2  药物花生油，山东鲁花集团有限公司生产，批号20041231。100%薄荷油，上海香料总厂购买，批号20041207，按照《中国药典》2000版标准生产，相对密度0.888～0.908，含酯量按醋酸薄荷酯(C12H22O2)计算为2.0%～6.5%(g/g)，含总醇量按薄荷脑(C10H20O)计算不少于50%(g/g)。四氯化碳，分析纯，北京化工厂生产，批号20010925。实验前以花生油将薄荷油与四氯化碳配制成所需浓度(V/V)。
       1.3   试剂总胆红素（TB）试剂1，批号 KF908；TB试剂2，批号 KF914，均由和光纯药工业株式会社 (WAKO)生产。碱性磷酸酶（ALP）试剂，批号ZG5002；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂，批号ZG5001；天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂，批号ZG3004，均由济南希森美康医用电子有限公司(sysmex)生产。SOD检测试剂盒，批号20060629；MDA检测试剂盒，批号20060530，均由南京建成生物工程研究所提供。
       1.4  仪器奥豪斯电子天平SR6010，奥豪斯国际贸易上海有限公司生产；全自动生化分析仪HITACHI7020，日本HITACHI公司生产；系统显微镜BX51/BX52，日本奥林巴斯光学株式会社生产；全能型脱水机，徕卡公司生产。722型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产。
       2  方法
       2.1  口服半数致死量(LD50)测定取小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只。6个给药组在3.7～2.2  ml/kg之间按照等比级数(0.9)确定6个给药剂量。各给药组按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常组同时灌服等容量花生油。连续观察14 d。观察并记录给药后的一般状况和死亡情况，死亡小鼠肝脏剖解后肉眼观察。
       2.2   口服“时间－毒效”关系研究取小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，按处理时间点依次为0 ，6 ，12 ，24，48 ，72 h组。按0.1 ml/10 g灌胃1次，0 h组小鼠灌服花生油，其余各组灌服23%薄荷油。于相应时间点称量小鼠体重，摘眼球取血，3 000 r/min离心10 min，取血清，以全自动生化分析仪测定血清TB，ALP，ALT，AST。摘取小鼠肝脏，称重并计算肝脏指数［4］。
       2.3  口服“剂量－毒效”关系研究取小鼠48只，雌雄各半，随机分为4组，即正常组和薄荷油低、中、高剂量组。按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常组灌服花生油，薄荷油各剂量组分别灌服9%，15%，23%的薄荷油。48 h后，按“2.2”方法测定血清TB，ALP，ALT，AST，计算肝脏指数。另取一部分肝组织，常规HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学变化。对肝组织形态进行病理分级、积分［5］：肝组织结构正常，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润(0)，0分；肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀、气球样变或脂肪变性，散在点状坏死(＋)，1分；肝小叶结构不清，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润(＋＋)，2分；肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死,伴有炎症细胞浸润(+++)，3分；坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，层次较多，伴有炎症细胞浸润(++++)，4分。
       2.4   肝毒性的自由基损伤机理研究取小鼠40只，雌雄各半，随机分为正常组、薄荷油24 h组、薄荷油36 h组、四氯化碳组。按0.1 ml/10 g灌胃1次，正常组灌服花生油，薄荷油组灌服23%薄荷油，四氯化碳组灌服5%四氯化碳。给药24 h后，摘取正常组、薄荷油24h组、四氯化碳组小鼠肝脏；给药36 h后，摘取薄荷油36 h组小鼠肝脏。按试剂盒说明书操作，分光光度计于550 nm波长处测定样品吸光度，计算SOD活力；于532 nm波长处测定样品吸光度，计算MDA含量。
       2.5   统计方法
       Bliss法计算LD50，LD10和LD1。Radit法对肝组织病理积分的数据进行统计分析。计量资料采用±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计处理，两组间比较采用t检验法，多组间比较采用单因素方差分析法。P<0.05为差异有显著性。
       3  结果
       3.1  口服LD50
       3.1.1  给药后的一般状况部分小鼠给药后半小时开始出现步履蹒跚，行走易向一侧摔倒，继而行动迟缓，气息微弱。随时间推移，出现异常反应的小鼠部分死亡。死亡小鼠肝脏肉眼检查可见有不同程度的颜色变深、表面粗糙等。大多数小鼠的异常反应出现在给药后24～48 h，部分有异常反应的小鼠可逐渐恢复正常。
       3.1.2  死亡情况正常组小鼠死亡为0；薄荷油各组按剂量从低到高的死亡数依次为0，2，3，6，6，9。计算LD50为3.0 ml/kg，95%可信限为2.8～3.3 ml/kg；LD10为2.3 ml/kg,95%可信限为1.7～2.6 ml/kg；LD1为1.7 ml/kg，95%可信限为0.6～2.1 ml/kg。3.2   口服“时间－毒效”关系给药6 h后，血清TB，ALP，ALT，AST值均有显著升高，其中TB， ALP在24 h达到最高值，可持续到48 h；ALT在48 h达到高峰。给药12 h后的肝脏明显肿大，肝指数升高。72 h组小鼠处理时，结果显示，各指标已恢复近正常值。见表1。表1  小鼠1次口服2.3 ml/kg薄荷油后血清TB，ALP，ALT，AST和肝脏指数的时间变化（略）
       3.3  口服“剂量－毒效”关系
       3.3.1  对血清TB， ALP， ALT，AST的影响与正常组相比，薄荷油中剂量组ALP升高，有显著性差异(P<0.05)；随着剂量增大，高剂量组的ALP，ALT，AST均升高，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果见表2。表2   小鼠1次口服不同剂量薄荷油对血清TB，ALP，ALT，AST的影响(略)
       3.3.2  对肝组织形态的影响给药48 h后，正常组与薄荷油低、中、高剂量组的肝脏指数(g/10 g)依次为（0.455±0.099），（0.469 ±0.038），（0.496±0.041），（0.629±0.046）。与正常组比较，高剂量组肝脏肿大，肝脏指数显著升高(P<0.01)。光镜下观察，正常组肝小叶结构清晰完好，肝细胞未见明显变性、坏死，肝窦未见明显淤血扩张；低剂量组与正常组基本相同；中剂量组除3例无明显变性坏死外，其他9例肝脏均出现不同程度的肝细胞水肿，未见明显坏死性改变。高剂量组3例出现肝细胞灶性坏死，3例出现肝细胞片状坏死，其余6例均出现不同程度的肝细胞水肿。积分统计结果表明，与正常组比较，薄荷油中、高剂量组对肝组织损伤有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结果见表3。表3  小鼠1次口服不同剂量薄荷油对肝组织形态的影响（略）
       3.4   肝毒性的自由基损伤机理小鼠1次口服2.3 ml/kg薄荷油24 ，36 h后，肝组织SOD降低而MDA升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.05)，其变化与四氯化碳组相似。结果见表4。表4  小鼠1次口服薄荷油对肝组织SOD、MDA的影响（略）
       4  讨论
       薄荷油应用非常广泛，但对其毒性研究并不多。Ilene B. Anderson等［1］报道了4例服用薄荷油中毒的病例，并回顾了既往文献中18例服用薄荷油中毒的病例，这些病例的中毒主要表现在中枢神经系统、肝和肾方面。陈光亮等［2］在小鼠薄荷油急性毒性实验中，观察到中枢神经系统毒性，其腹腔注射LD50为（1144.9±78.5）mg/kg(根据薄荷油相对密度折算为1.3 ml/kg左右)。Vo LT等［3］在离体实验中发现，0.5 microL/mL薄荷油可以导致离体培养的人肝脏细胞死亡。由于薄荷油多用于口服，因此为了更安全使用薄荷油，了解其口服毒性特点及其机理，对其进行毒性研究是非常必要的。
       
       本实验对小鼠薄荷油LD50研究显示：小鼠口服大剂量薄荷油后可出现步履蹒跚，行走易向一侧摔倒等神经系统的毒性反应，还能对肝脏造成一定损伤；本实验小鼠口服薄荷油的LD50为3.0 ml/kg左右，与陈光亮等的报道有较大差异，这可能是由于给药途径不同造成的，而口服给药是临床最常用的给药途径，《中国药典》规定，成人口服薄荷油一日不超过0.6 ml［6］，即小鼠的口服LD50，LD1大约分别相当于成人常用量的300倍，170倍左右。
       本实验对薄荷油致小鼠肝毒性时-效关系的研究显示：小鼠口服2.3 ml/kg的薄荷油后，血清TB，ALP， ALT，AST等肝功能指标随时间推移逐渐增高，在24～48 h达到高峰，然后逐渐下降，72 h时可恢复近正常；肝脏指数也呈现同样的变化趋势。量效关系的研究显示：小鼠一次口服中剂量的薄荷油，即可出现血清ALP升高、肝细胞水肿等变化；一次口服高剂量的薄荷油，不仅血清ALP，ALT，AST和肝脏指数等指标全面升高，而且肝细胞还可出现严重水肿、脂肪变性、灶性坏死、片状坏死等改变；而小鼠口服低剂量的薄荷油，则未见对肝脏有明显影响。这表明，服用薄荷油超过一定量后，可导致急性肝损伤，损伤可表现为肝功能甚至肝组织病理学的改变，并呈现明显的量效关系，损伤高峰出现在服药后24～48 h。
       本实验还对薄荷油肝毒性机制在自由基损伤方面作了初步研究。如果大量的自由基在肝细胞内产生，即可攻击脂质、蛋白质及核酸的双键结构，激发脂质过氧化物，导致质膜损伤。当细胞质膜受损时，膜通透性发生改变，存在于胞浆或线粒体内的ALT，AST释放到血液中，使血中ALT，AST活性升高。如果受损质膜完全失去完整性，细胞内容物倾出，可导致细胞死亡。测定肝组织SOD和MDA的含量可间接反映其脂质过氧化反应的程度及细胞损伤程度。在小鼠口服薄荷油的毒性高峰期，SOD显著降低而MDA明显增高，光镜下可见肝细胞水肿、变性、坏死等改变，由此推测：在薄荷油导致的肝细胞病理变化中，过氧化损伤可能是其机制之一，在这方面与四氯化碳的肝毒性机理极为相似。薄荷油在日常生活及临床上应用较多，一般认为是无毒的。但本文研究结果表明，本品一次服用大剂量本品可产生明显的急性毒性，包括引发肝损伤。这需要引起重视。薄荷油导致肝损伤的机制还有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］Ilene B. Anderson, Walter H. Mullen, James E. Meeker, etal. Pennyroyal toxicity: measurement of toxic metabolite levels in two cases and review of the literature［J］. Ann Intern Med,1996, 124(8):726.
       
       ［2］陈光亮，姚道云，汪远金，等.薄荷油药理作用和急性毒性的研究［J］. 中药药理与临床，2001，17(1)：10.
       
       ［3］Vo LT, Chan D, King RG. Investigation of the effects of peppermint oil and valerian on rat liver and cultured human liver cells. Clin Exp Pharmacol Physiol［J］. 2003，30(10):799.
       
       ［4］徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，1991：932.
       
       ［5］阎向东，童 英，郑 珊，等.急性四氯化碳致大、小鼠肝损害程度的比较［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（8）:989.
       
       ［6］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：283.