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       【摘要】 
       目的探讨长春新碱（Vincristine，VCR）对L615白血病的疗效及其可能机制。方法L615白血病造模成功后，分为对照组和VCR组，进行腹腔注射给药（对照组给生理盐水），隔日一次，连续6次。观测小鼠生存时间，体重变化，外周血白细胞计数，肝脾指数，肝脾骨髓涂片及骨髓白细胞分类，流式细胞术测定凋亡率。结果对照组体重明显减轻，VCR组体重无明显改变；VCR组小鼠生存时间是对照组的229%；外周血象，同组小鼠随病程的延长，白细胞逐渐上升，至濒死期则显著上升，与实验前比较有显著差异，且对照组更为显著，而血小板是先升后降，至濒死期，末梢血对照组出现大量L615白血病细胞，占白细胞总数的52.9%，VCR组L615白血病细胞占17.25%，两者具有显著差异（P<0.01）；白血病死亡小鼠脾脏指数有差异(P<0.05)，且VCR组脾指数大于对照组；流式细胞术证实，VCR能诱导L615白血病体内细胞凋亡，凋亡率达43.81%。结论VCR对L615白血病具有较好的疗效，其机制主要是诱导白血病细胞凋亡；VCR在抗肿瘤的同时，可能对正常组织尤其是免疫系统具有一定的损害作用。
       【关键词】  长春新碱 L615白血病 生命延长率 细胞凋亡 流式细胞术
       Research on the Curative Effects and Mechanisms of VCR on L615 Leukemia
       ZHU Dacheng, YIN Xiaoming, CHEN Xiuzhen, LUO Xiaoquan, MIN Jianxin
       1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
       2. Jiangxi Provincial People"s Hospital, Nanchang 330006, China;
       3. Jiangxi Provincial Cancer Hospital, Nanchang 330029, China
       Abstract:ObjectiveTo discuss the curative effects and the potential mechanisms to the L615 leukemia of VCR. MethodsAfter making the model successfully, put the mice into 2 groups, antitheses one and VCR group. Then carry on the celiac injection (the antitheses one with NS), once every other day, and totally 6 times. Observe the survival time, weight changes, peripheral blood leukocyte count, hepatosplenic index, hepatic, splenic and marrow swears and marrow leukocyte classification and apoptosis rate determined by FCM.ResultsThe antitheses group"s weight declined significantly; but no obvious changes in VCR group were observed. The survival time of VCR group was 229% of the antitheses one. For the peripheral blood, with the course of diseases extending, the leukocytes increased and notably in the dying period (notably differences compared with the situation before the experiment, especially in antitheses group); the platelets first increased and then decreased and till the dying period. There were large amount of L615 cells in the peripheral blood of antitheses group (52.9% of the leucocyte number); 17.25% in VCR group was L615 cells, but there were still great differences between the two groups(P<0.01). The splenic indexes of the dead mice were different (P<0.05), and that of VCR group was greater. FCM proved that VCR induced the apoptosis of L615 cells in vivo, and the rate reached to 43.81%. ConclusionVCR has good curative effects on L615 leukemia. To induce the apoptosis of leukemia cells is its main mechanism. It may damage the normal tissues, especially the immune system when it is repelling the tumor.
       Key words:VCR;   L615 leukemia;   Life extension rate;   Apoptosis;   FCM
       长春新碱（VCR)作为抗肿瘤化疗药早已应用于临床。有实验证明VCR能诱导髓系白血病HL-60，U937，K562等细胞凋亡［1～3］，。这次我们利用VCR作用于可移植性小鼠淋巴细胞白血病——L615白血病，观察其疗效，并探讨其可能机制。
       1  材料与方法
       1.1  药品及试剂
       VCR为上海华联制药有限公司产品（批号：050602A），用生理盐水配成浓度为25 μg/ml的VCR溶液备用。细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。
       1.2  细胞培养L615白血病细胞株购于中国医学科学院血液研究所（天津）。培养基为含体积分数10%的小牛血清（杭州四季青）的RPMI-1640（Gibco公司产品），并加入双抗（青霉素100 μ/ml和链霉素100 μg/ml）, 在37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱（Therno Forma公司产品）中培养，取对数生长期细胞进行造模。
       1.3  模型建立
       
       取对数生长期L615白血病细胞（L615细胞），离心1 500 r/min,8 min,去上清液，用生理盐水洗涤2次，调整细胞终浓度为1.4×106/ml。取615近交系小鼠（购自中国医学科学院血液研究所）8只，鼠龄10周，体重24～27 g，雌雄各半。无菌操作，每只小鼠腹腔接种L615细胞7×105个，造成L615白血病模型（全身白血病）［4］。小鼠在层流架内饲养，一切与鼠接触的物品均按无菌要求处理。
       1.4   分组及给药方法
       将L615白血病模型小鼠随机分为2组。每组雌雄各半，即对照组（L615模型组）(每次每只鼠给生理盐水0.4 ml) ；VCR组（每次每只鼠给VCR 0.3 mg/kg）。模型建立后，第2天开始按以上方案腹腔注射给药，隔日1次，共给药6次。
       1.5   观测指标 
       ①体重变化；②生存时间，用公式（T-C）/C×100%计数其生命延长率（T、C分别为VCR组，对照组平均生存天数）；③外周血白细胞（WBC）计数及分类，血小板（PLT）计数；④肝脾指数；⑤肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类。
       1.6   流式细胞术（FCM）分析 
       取濒死期两组小鼠外周血，每个样本0.5ml入已加淋巴细胞分离液的试管内，离心1500r/min，20min，然后小心吸出位于中间的白色层（白细胞），进行细胞计数（每个样本细胞数应大于1×106），用PBS洗涤，然后按凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒要求进行操作。上机检测（流式仪为BECTON DICKNSON,B、D公司产品），采用CenQuest软件获取10 000个细胞，ModFitlt软件分析并获得结果。
       1.7  统计学处理 
       采用双侧t检验，P<0.05认为差异有显著性。
       2  结果
       2.1   体重变化
       VCR组给药前，给药后第5天及濒死期小鼠体重无明显改变，但对照组濒死期与给药前比较，体重有所减轻，且具有显著性差异（P<0.05）。结果见表1。表1  两组小鼠体重的变化比较(略)g
       2.2   生存时间 
       VCR组与对照组比较,生存时间显著延长（P<0.01），其延长时间及生命延长率见表2。表2   两组小鼠生存时间比较（略）
       2.3   外周血象
       给药5 d后，同组与实验前比较白细胞及血小板数逐渐上升，且VCR组血小板增高有显著意义。进入濒死期，白细胞数显著增高（P<0.01），L615模型组呈直线上升，两组比较具有显著差异，血小板先升后降，同组比较具有显著差异。在给药后第5天外周血未发现L615细胞，但进入濒死期模型组白血病细胞骤增至50.25%，VCR组L615细胞占17.25%，与对照组比较，具有显著性差异。结果见表3。表3  两组小鼠外周血WBC，PLT计数及L615细胞百分比比较（略）
       2.4  肝脾指数 
       解剖两组死亡小鼠，发现肝、脾明显肿大，VCR组脾肿大更显著。肝脏指数差异不显著，但脾脏指数VCR组比对照组显著增高（P<0.05）。结果见表4。表4  两组小鼠肝脾指数比较（略）
       2.5  肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类 
       对照组及VCR组小鼠死亡后，取其肝、脾、骨髓进行涂片（解剖时见胸腹部皮下有出血点且对照组出血点更广泛而密集，多处形成淤斑），瑞氏染色。油镜下可见，两组肝、脾、骨髓内绝大部分为L615细胞，且生长旺盛，细胞体积比体外培养时显著增大，形状不规则，胞浆少，嗜碱性，核浆比例严重失调，胞核体积远大于胞浆；核染色质粗，核仁1～数个。总的印象：肝、脾、骨髓内L615细胞形态结构相似，但VCR组脾内细胞体积比肝、骨髓内的要大，强嗜碱性（图1）。骨髓白细胞分类见表5。VCR组L615细胞百分比比对照组少但无统计学意义。表5   两组小鼠骨髓WBC及L615细胞百分比比较（略）
       2.6  流式细胞仪测定白细胞凋亡率 
       根据FCM检测结果可知（图2），VCR对L615白血病小鼠白血病细胞具有强的诱导凋亡作用，凋亡百分率达43.81%，而对照组仅为0.33%（UR代表右上象限百分率，为晚期凋亡，LR代表右下象限百分率，为早期凋亡，两者之和为凋亡细胞百分率）。结果见表6。表6  两组小鼠白细胞凋亡率比较（略）
       
       3  讨论
       本研究结果显示：VCR作用于L615白血病小鼠后，能显著延长小鼠生命，生命延长率达229%；试验前后，VCR组小鼠体重变化不大，而对照组体重明显减轻；外周血象随着L615小鼠病程延长，白细胞数逐渐升高，而血小板是先升后降。病程进入濒死期，白细胞则显著增高，对照组更为显著，但血小板却显著降低，这与解剖所见对照组皮下出血更严重相一致。这说明VCR对L615细胞侵犯骨髓具有抑制作用。流式细胞术证实，VCR能诱导L615白血病小鼠体内白血病细胞的凋亡，这说明VCR对L615白血病具有疗效，其机制之一是诱导细胞凋亡。脾脏涂片显示两组脾脏显著增大，但VCR组脾脏高度肿大，含大量L615细胞，这说明L615细胞已严重侵入免疫系统，VCR对机体免疫系统不具保护作用，这与文献［5］相一致。在病程晚期，肝、脾、骨髓发现大量L615细胞，说明VCR在抗肿瘤的同时，对机体正常细胞可能也具有一定的杀伤作用。
       目前，白血病的长期缓解率和生命延长率低，且易复发，原因之一是白血病细胞对化疗药物产生多药耐药性［6］，其次化疗药对机体正常细胞及免疫系统也具有一定的损伤作用。因而白血病的治疗还有许多问题亟待解决。中草药乃我国国粹，因其毒副作用小的优点，在白血病耐药逆转研究中引起了广泛关注，例如人参皂甙Rb1能提高白血病细胞HL-60/VCR对化疗药物的敏感性［7］，我们以往研究证实蟾酥对小鼠淋巴细胞白血病具有疗效及对免疫系统具有一定的保护作用［8］。因此，寻找新的中草药对白血病耐药株的逆转作用或中草药与化疗药协同治疗白血病是今后的努力方向之一。
       【参考文献】
         　　［1］史泓浏，王晓怀，江悦华，等．微波和长春新碱体外净化白血病细胞的研究［J］.中华物理医学与康复杂志，1999，21(3):162．
       
       ［2］肖广芬，卢 青，杨向东．P73基因在长春新碱诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中的表达［J］.中国现代医学杂志，2002，12(5):31．
       
       ［3］黄伟，张瑶珍，周剑锋，等．长春新碱对K562细胞plk1和γ-微管蛋白表达影响的研究［J］.中国药理学通报，2005，21(3):295．
       
       ［4］储建新，李肇梅．615近交系小鼠及其在实验肿瘤研究中的应用［M］.北京：人民卫生出版社，1989：112.
       
       ［5］阮长耿，吴德沛，李建勇，等. 现代血液病诊断治疗学［M］.合肥：安徽科学技术出版社，2007：197.
       
       ［6］陈莉, 许小平, 王健民, 等. 裸鼠高成瘤性多药耐药白血病细胞系的建立及其生物学特性研究［J］.第二军医大学学报, 2004, 25(5):507.
       
       ［7］立彦, 王自正, 俞腾飞. 人参皂甙Rb1对耐长春新碱的急性早幼粒白血病(HL60/VCR)细胞多药耐药逆转的实验研究［J］.放射免疫学杂志, 2005, 18(5):362.
       
       ［8］朱大诚，尹小明，陈秀珍，等. 蟾酥对可移植性小鼠淋巴细胞白血病疗效的研究［J］.时珍国医国药，2007，18（11）：2645.