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       【摘要】 
       目的探讨超滤分离当归多糖组分的可行性及其对各组分总糖含量和蛋白含量的影响。方法新鲜岷县当归经80%无水乙醇回流除去脂溶性成分，水提醇沉提取当归粗多糖。将当归粗多糖用蒸馏水溶解，反复冻融除蛋白后，超滤分离出不同分子量的当归多糖组分，并测定各组分的总糖含量及蛋白含量。结果超滤得到分子量分别为10 ～30 kD，30 ～300 kD和>300 kD的3个组分，其颜色分别为棕褐色、淡黄色、类白色；总糖含量分别为40.15%，62.12%和80.33%；蛋白含量分别为2.88%，0.98%和0.74%；当归多糖中以分子量>300 kD的当归多糖组分为主，占当归干重的5.48%。结论超滤分离当归多糖，可得到总糖含量较高而蛋白含量较低的主要组分，且操作简单，适于规模化生产。
       【关键词】  超滤 分离 当归多糖 含量测定
       Effect of Ultrafiltration on Total Sugar Content and Protein Content of Angelica Sinensis Polysaccharide Fractions
       LIU Xinyou, ZHOU Siyuan,CHENG Jianfeng, ZHANG Yan,LIU Linna,MEI Qibing
       1. Department of Pharmacy, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi"an 710038, China；
       2. Department of Pharmacology, the Fourth Military Medical University, Xi"an 710032 , China
       Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of isolating Angelica sinensis polysaccharide fractions by ultrafiltration and the effect of ultrafiltration on total sugar content and protein content of these fractions. MethodsThe fresh plant DangGui from Min-xian county was circumfluenced in 80% ethanol to remove the lipophilic fraction. Rude polysaccharide was obtained by adding ethanol to its concentrated solution extracted in distilled water. The rude polysaccharide was dissolved in distilled water and was deproteinized by repeated freeze thawing, then the different polysaccharide fractions were isolated by ultrafiltration. The contents of the total sugar and the protein of these fractions were determined.Results Three fractions with different molecular weight of 10 ～30 kD, 30 ～300 kD and >300 kD were obtained. The colors of these fractions were dark brown, light yellow and off-white color, respectively. The total sugar content was 40.15%, 62.12% and 80.33%, respectively. The protein content was 2.88%, 0.98% and 0.74%, respectively. The main component of Angelica sinensis polysaccharide was the fraction with large molecular weight (>300KD), which accounted for 5.48% of dry DangGui. ConclusionThe main fraction of Angelica sinensis polysaccharide obtained by ultrafiltration has higher total sugar content and lower protein content and the isolation by ultrafiltration is easy to operate, hence, it is suitable to isolate Angelica sinensis polysaccharide fractions in large scale.
       Key words:Ultrafiltration;  Isolation;   Angelica sinensis polysaccharide;   Content determination
       
       当归多糖是一种多组分多糖，分子量范围很广，因为药材产地、采集时间以及提取方法的不同其组成会有很大变化。现代药理学研究证实，当归多糖具有增强免疫［1］、提高造血功能［2］、保肝［3］、抗肿瘤［4］、抗辐射损伤［5］及促进胃肠道黏膜上皮细胞的移行与增殖，拮抗泼尼松龙引起的外周血白细胞减少，加速胃肠道损伤黏膜修复等作用［6］，还能作为载体合成具有结肠靶向递药特性的地塞米松前体药［7］。但当归多糖常采用凝胶柱进行分离，效率低，成本高。本实验拟采用超滤分离当归多糖组分，并对各组分的总糖含量和蛋白含量进行分析。
       1  材料与仪器
       甘肃岷县新鲜当归，于每年霜降后采收。无水乙醇，无水葡萄糖，浓硫酸，磷酸均为分析纯；重蒸苯酚（陕西建华生物有限公司）；Serva blue-G-250染料（华美生物工程公司）；牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）。MM12型食品绞碎机（广东省韶关市食品机械厂），10 L调温式电热套（北京科伟永兴仪器有限公司），RE52-05型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），CR21F型高速离心机（Hitachi），真空泵（河南巩义市英裕予华仪器厂），冷冻干燥机（FTS Systems），DU-800紫外分光光度计（Beckman），Pellicon标准超滤仪和Pellicon-2超滤膜包为Millipore公司生产。
       2  方法与结果
       2.1  当归药材的预处理岷县新鲜当归，清水洗净后，用食品绞碎机绞碎，浸泡于无水乙醇中保存。取醇浸当归，以85%乙醇回流提取3次，2 h/次。醇提当归渣自然晾干，备用。
       2.2   当归总多糖的提取取处理后的干当归渣500 g，加入20倍蒸馏水回流提取3次，时间分别为3 ，3 ，2 h。合并3次提取液，60 ℃减压浓缩至5 000 ml，放冷，3 000 r/min 离心10 min，上清液继续浓缩至呈稠膏状，加入3倍量（体积）无水乙醇，边加边搅拌，静置自然沉淀。倾去上层乙醇液，余下部分以3 000 r/min 离心10 min，得到淡黄色的当归粗多糖。
       2.3  反复冻融除蛋白取离心得到的当归粗多糖，按湿重加入4倍量的蒸馏水溶解，于－20 ℃反复冻融8次，3 000 r/min离心20 min除蛋白。
       2.4 超滤分离当归多糖组
       分除蛋白后的当归多糖液加两倍量的蒸馏水稀释，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，以10 kD的超滤膜透析除去小分子杂质，然后依次用300 kD，100 kD和30 kD的超滤膜分离。将分离的组分液减压浓缩，冷冻干燥，得到分子量分别为10～30 kD，30～300 kD和 >300 kD 3个当归多糖组分。超滤得到的当归多糖组分，随分子量的增加，其颜色逐渐变浅；当归多糖中以大分子的当归多糖为主，其中分子量>300 kD组分占当归干重的5.48%。结果见表1。表1  当归多糖组分的性状及收率
       组分颜色 收率（略）                    
       
       收率以所得多糖占干当归渣干重的百分比表示。
       2.5 总糖含量测定方法
       采用改良的苯酚－硫酸法测定总糖含量［8］。重蒸苯酚用蒸馏水配成60 g/L 的溶液。精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖15 mg，用蒸馏水定容至100 ml，使成150 μg/ml的葡萄糖储备液。
       2.5.1  标准曲线制备
       
       分别精密量取葡萄糖储备液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml于10 ml具塞圆底试管中，各加蒸馏水至1 ml，振摇混匀，使成15.00，30.00，45.00，60.00，75.00，90.00，105.00 μg/ml的葡萄糖标准工作液。于各管中分别加入60 g/L的苯酚溶液0.6 ml，浓硫酸3 ml，漩涡振荡器振荡均匀，放置15 min,于490 nm处测定吸光度，每个浓度平行做3组，计算平均吸光度值。空白校正用蒸馏水1 ml按上法平行操作。以测得的平均吸光度值(Y)对葡萄糖标准工作液的浓度（X，μg/ml）作线性回归，得测定总糖含量的标准曲线回归方程为Y=0.013 6 X+0.019 4，r=0.999 6，线性范围15.40～107.80 μg/ml。
       2.5.2   准确度和精密度实验
       分别配制23.10，61.60，100.10 μg/ml的葡萄糖溶液，按标准曲线制备方法操作，同1日内连续测定5次，计算平均回收率及日内RSD；3个浓度每天各测定1次，连续测定5 d，计算日间RSD。结果见表2。表2  总糖含量测定方法的准确度和精密度（略）
        
       2.6  蛋白含量测定方法
       采用Serva blue-G 染料结合法［9］测定当归多糖中的蛋白含量。Serva blue-G储备液的配制：称取Serva blue-G-250 70 mg，用95%乙醇20 ml溶解，加入85%磷酸40 ml，摇匀，于室温存放。Serva blue-G工作液的配制：取Serva blue-G储备液3 ml，95%乙醇1.5 ml，85%磷酸3 ml，用双蒸水定容于50 ml，棕色瓶存放，室温保存，用前过滤。牛血清白蛋白（BSA）储备液配制：精密称取BSA 4 mg, 用生理盐水溶解并定容于100 ml容量瓶中，使之成浓度为40 μg/ml的BSA储备液。
       2.6.1  标准曲线制备
       取BSA储备液用生理盐水分别配制浓度为5.00，10.00，15.00，20.00，25.00，30.00 μg/ml的BSA 系列标准溶液。取BSA 系列标准溶液各1 ml，分别置于1次性聚乙烯试管中，每管均加入Serva blue-G工作液1 ml，漩涡振荡器混匀。空白校正用生理盐水1 ml平行操作。2 min后于595 nm测定吸光度，1 h内测定完毕。每个浓度平行做3组，求出平均吸光度值。以测得的平均吸光度值(Y)对BSA 系列标准溶液浓度（X，μg/ml）作线性回归，得到测定蛋白的标准曲线回归方程为Y=0.014 3X+0.064 3，r= 0.999 8，线性范围5.24～31.42 μg/ml。
       2.6.2  准确度和精密度
       实验取BSA储备液用生理盐水分别配制浓度为8.38，16.76，25.14  μg/ml的BSA溶液，按标准曲线制备方法操作，同1日内连续测定5次，计算平均回收率和日内RSD；3个浓度每天测定1次，连续测定5 d，计算日间RSD。结果见表3。表3  蛋白含量测定方法的准确度和精密度（略）
       2.7  各组分总糖含量和蛋白含量的测定
       精密称取当归多糖各组分25 mg，分别用蒸馏水溶解定容至50 ml，使成500 mg/ml的样品溶液。取样品溶液0.2 ml按总糖含量测定方法项下方法操作，于490 nm测定吸光度，每个样品平行做3组，同时以蒸馏水1 ml平行做空白校正。以测得的平均吸光度值代入测定总糖含量的标准曲线回归方程，计算各组分总糖含量。取样品溶液1 ml，按蛋白含量测定方法项下方法操作，于595 nm测定吸光度，每个样品平行做3组，计算平均吸光度值，同时以生理盐水1 ml平行做空白校正。以测得的平均吸光度值代入测定蛋白含量的标准曲线回归方程，计算各组分蛋白质含量。测定结果表明，随着当归多糖组分分子量的增大，其总糖含量增加，蛋白含量降低，其中分子量大于300 kD组分的总糖含量高达80.33%，蛋白含量仅为0.74%。结果见表4。表4   当归多糖组分的总糖含量及蛋白含量（略）
       表中的未超滤多糖为反复冻融除蛋白后的冻干品。
       3   讨论
       当归为块状根茎类，在干燥过程中由于其所含的酶类可能会使多糖的组分发生变化，因此市售干当归提取的多糖其质量不易控制。有些药商在炮制过程中采用了硫磺熏制的办法，在当归切片时为了防止粘连还涂抹了油性物质，用这种饮片提取的当归多糖性状较差，醇沉后粘性大，总糖含量低，质量难以控制。鉴于此，我们选用了新鲜当归，将新鲜当归药材绞碎后，以无水乙醇浸泡的方法对当归药材进行预处理。无水乙醇浸泡可以除去一部分脂溶性成分，破坏细胞脂膜，有利于水提时当归多糖的浸出，同时还能破坏当归药材中的酶类，使多糖的组分保持稳定，最大程度上保证了提取的当归多糖的质量可控性。
       当归多糖提取纯化的关键步骤是除色素和蛋白，乙醇预处理虽可除去一部分色素，但提取的多糖依然有较深的颜色。我们最初考虑用活性炭脱色，但在实验过程中发现，当归多糖溶液粘性较大，加入的活性炭很难除去。另外加活性炭处理得到的当归多糖总糖含量较低，可能是活性炭吸附了大量的多糖，而对其它杂质的吸附较少所致，这可能对其组成产生很大影响。因此，我们认为活性炭不适合于当归多糖的脱色。当归多糖中含有的植物蛋白会影响其内在质量。常规除蛋白多采用三氯乙酸法和鞣酸法，但在酸性条件下可能造成多糖的降解；Sevag法在避免多糖降解方面效果较好，但试剂消耗量大，也可能造成氯仿等有机溶剂的残留。商澎等［10］将当归多糖液置于-20 ℃反复冻融除蛋白，因此我们采用了反复冻融的方法除蛋白。超滤结果表明，分子量小的组分颜色较深，而分子量300 kD以上组分为类白色；蛋白含量测定表明，随分子量组分的增大，蛋白含量降低，300 kD以上组分所含的蛋白是反复冻融除蛋白后当归多糖的46.25%，是10～30 kD组分的25.69%，因此超滤有利于除去大分子量多糖组分中的色素和游离蛋白。从总糖含量测定结果可以发现，高分子量当归多糖组分的总糖含量高，而分子量越低的组分，其总糖含量越低，说明当归多糖的杂质主要是低分子量的物质。超滤分离当归多糖组分的收率表明，当归多糖中以分子量300 kD以上组分为主，达到药材干重的5%以上，且该组分的总糖含量亦高达80%以上。
       综上所述，超滤可用于分离当归多糖组分，并且可以起到去除主要组分（>300 kD）中色素和蛋白的作用，而且超滤法操作简单，适于规模化生产。
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