文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究川芎嗪对癫痫的作用及其与白细胞介素-1受体( IL-1R)的关系。方法用腹腔注射戊四氮制作大鼠癫痫模型,致痫前后分组分别给予川芎嗪,观察大鼠出现癫痫发作的潜伏期及持续时间,并用脑电图仪和免疫细胞化学方法研究川芎嗪对癫痫大鼠脑电图和皮层及海马区IL-1R免疫反应阳性细胞的影响。结果对照组无癫痫发作。致痫前给予川芎嗪组大鼠较癫痫组大鼠癫痫发作潜伏期延长,持续时间缩短，差异有显著意义(P< 0. 01) ,脑电图高电位痫样波发放减少,大脑皮层和海马IL-1R免疫反应阳性细胞数减少，差异有显著意义( P< 0. 01) 。致痫后给予川芎嗪组,上述指标与癫痫组相比,差异无显著意义（P> 0.05) 。结论川芎嗪能抑制癫痫发作，其作用机制可能与通过白细胞介素-1对免疫-神经的调节有关。
       【关键词】  川芎嗪 癫痫 白细胞介素-1受体 戊四氮 免疫-神经
       The Antiepleptic Effect of Tetramethylpyrazine and its Relationship to Tinterleukin1 Receptor
       ZHU Xiaoqin,LIU Guohui, HU Jingxin
       Guangzhou Medical College, Guangzhou, Guangdong 510182, China
       Abstract:ObjectiveTo study the effects of tetramethylpyrazine(TMP) in treating epilepsy and its relationship to interleukin-1 receptor. MethodsThe epilepsy model of rats was induced by intraperitoneal pentylenetetrazol(PTZ) injection before and after tetramethylpyrazine (TMP ) was administered respectively. The latency and continuous time of epilepsy rats were observed. The influence of TMP on eletroencephalogram( EEG) and the expression of interleukin1 receptor β in cortex and hippocampus were also investigated by means of EEG and immunocytochemistry.ResultsTMP could decrease the activities of GPT and GOT in serum and the MDA , XOD , NOS and iNOS content of liver tissue , and increase the activities of GSH-PX content of liver tissue. In vitro, it indicated that TMP had a notable protective effects on the hepatocyte injured by CCl4 and could suppress the level of GPT. Conclusion The action of TMP to suppress epilepsy discharge may have relationship to its regulation on immune- nervous affect by the expression of IL-1R.
       Key words:Tetramethylpyrazine(TMP); Epilepsy ;  Interleukin-1 receptor ;   Tetramethylpyrazine；  Immunfunction- nervous
       川芎嗪是伞形科植物川芎根茎中的主要化学成分之一,化学名为四甲基吡嗪,是从伞型草本科植物中提取的一种生物碱单体。在体内吸收后,能有效地透过血脑屏障,并广泛分布大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。笔者以往研究证明［1～4］：IL-1能诱发大鼠癫痫发作行为，川芎嗪能抑制大鼠癫痫模型的痫样放电，对大鼠癫痫模型神经细胞的损伤具有保护。本研究旨在探讨川芎嗪是否通过IL-1对免疫、神经的调节而影响神经系统的兴奋性，从而为川芎嗪治疗癫痫提供理论依据。
       1  材料与方法
       1.1  药品及试剂 
       川芎嗪注射液40 mg/2 ml(北京第四制药有限公司生产，批号20060701)，IL-1R检测试剂盒(HistostainTM-Plus kits)（购自北京宝赛生物技术有限公司）。
       1.2  动物分组及模型制备 
       采用健康雄性Wistar大鼠30只（广州医学院动物中心提供）,体重200～250 g,其中12 只按45 mg/ kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后, 固定于大鼠脑立体定向仪上,在双侧皮层和海马放置针电极。放养恢复1周后,随机分配到以下4 组,每组3 只。①对照组：取未埋电极的Wistar 大鼠3只,连同放置针电极大鼠3只,腹腔注射0. 9 %氯化钠注射液2 ml ,其中放置针电极的3只进行脑电图描记,45 min 后,按45 mg/ kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉取脑。②癫痫组:取Wistar大鼠5只,连同放置针电极大鼠3只,按4 mg/ kg 腹腔注射戊四氮致痫,记录癫痫发作潜伏期及发作程度和发作的持续时间。其中3只进行脑电图描记, 45 min后,按45 mg/ kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉取脑。③致痫前给予川芎嗪组:取Wistar大鼠5只,连同放置针电极大鼠3只,按40 mg/ kg 腹腔注射川芎嗪［5］，30 min后按4 mg/ kg 腹腔注射戊四氮致痫,记录癫痫发作潜伏期及发作程度和持续时间。其中3只进行脑电图描记。45 min后,按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠腹腔麻醉取脑。④致痫后给予川芎嗪组：取Wistar大鼠5只,连同放置针电极大鼠3只,按4 mg/ kg 腹腔注射戊四氮致痫,记录癫痫发作潜伏期及发作程度和持续时间。其中3只行脑电图描记。45 min后,按40 mg/ kg 腹腔注射川芎嗪,30 min后,按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉取脑。
       1.3  行为学表现
       根据Diehl［6］的评估标准，将大鼠的癫痫发作程度由轻到重分为0～Ⅴ级。0 级:无反应; I 级:节律性嘴和面部抽动; Ⅱ级：点头或甩尾; Ⅲ级：单肢抽动; Ⅳ级:多肢抽动或强直; Ⅴ级:全面性强直阵挛发作。
       1.4  脑电图描记 
       
       在双侧大脑皮层(顶区) 、海马放置针电极。电极定位:大脑皮层:前囟前2 mm ,中线旁2 mm ,硬膜下0. 5 mm。海马:前囟后3. 8 mm ,旁开2 mm ,硬膜下3. 6 mm。全部电极用牙托粉加502 胶固定。电极左皮层(L P) 、右皮层(RP) 、左海马(LH) 、右海马(RH) 依次分别与参考电极组成4 个导联描记。参考电极置于鼻尖利用A1 + A2 导线。定标2 mm= 50μV。行脑电图描记时,大鼠处于浅麻醉状态。
       1.5  实验步骤
       ①动物经用0. 3 %戊巴比妥钠(45 mg/ kg) 腹腔注射麻醉,断头取脑。修块到冠状位上最大海马层面,HE染色确证; ②冰冻切片厚6 μm 冷丙酮固定20 min 后吹干; ③按试剂盒说明书进行。其中一抗兔抗大鼠IL-1R IgG(1∶20) ,4 ℃过夜;二抗生物素化羊抗兔IgG(1∶100) ,37 ℃下置45 min。
       1.6   IL-1R 免疫反应阳性细胞观察
       取每只大鼠各2张切片,用20×显微镜观察所有切片中的阳性细胞数并平均后作为该组大鼠脑切片中阳性细胞数。皮层和海马分别记录。
       1.7  统计学处理
       
       计量资料随机设计分组的两小样本均数之间比较用t检验。
       2  结果
       2.1  行为学观察
       在4组大鼠中,除对照组无癫痫发作外,其余3组均出现Ⅰ～ Ⅴ级发作。从注入戊四氮开始到出现Ⅰ级发作时间为潜伏期;从出现Ⅰ级发作到不再发作时间为发作持续时间。其中癫痫组大鼠多为Ⅲ～Ⅴ级发作;致痫前给予川芎嗪组大鼠多为Ⅰ～ Ⅲ级发作;致痫后给予川芎嗪组大鼠,多为Ⅲ～Ⅴ级发作。各组大鼠川芎嗪发作潜伏期和持续时间见表1 。表1  各组大鼠癫痫发作潜伏期和持续时间比较(略)
       2. 2   脑电图记录对照组:注入生理盐水前后脑电图均以θ和α波为主要节律的基础波。癫痫组:注入戊四氮前,大鼠皮层和海马导联以θ和α波为主要节律。注入戊四氮5 min后出现中幅尖波,11～15 min ,尖波密度增加,偶有棘波、棘慢综合波,此后约45 min 有阵发性短程高幅棘波、尖波。致痫前注入川芎嗪组:注入川芎嗪前,大鼠皮层和海马导联均以θ和α波为主要节律,注入川芎嗪后,脑波无明显变化。注入戊四氮后12 min左右出现散在中幅尖波,此后约30 min有阵发性短程中幅尖波。致痫后给予川芎嗪组:注入戊四氮5 min后出现中幅尖波,13～17 min ,尖波密度增加,偶有棘波、棘慢综合波,持续到45 min 注入川芎嗪后,偶有阵发性短程中幅尖波。
       2.3  大脑皮层和海马IL-1R免疫组织化学结果对照组IL-1R免疫反应阳性细胞主要分布在海马CA2 ，CA3 区多形细胞层及顶区锥体细胞层。癫痫组大鼠IL-1R免疫反应阳性细胞分布范围同上,但阳性细胞数量较对照组显著增多,阳性细胞着色增强。致痫前给予川芎嗪组, IL-1R免疫反应阳性细胞分布范围同上但免疫反应阳性细胞数量减少,阳性细胞着色减弱。致痫后给予川芎嗪组,IL-1R免疫反应阳性细胞及阳性着色同癫痫组接近。各组阳性细胞数比较见表2 。表2  各组大鼠皮层和海马IL-IR免疫反应阳性神经细胞数(略)  
       3  讨论
       在免疫系统与神经系统相互调控中,中枢神经系统海马与免疫系统关系密切。海马在调节机体免疫系统功能同时也接受免疫系统影响［7］。有研究表明［8］：川芎嗪能抑制脑内IL-1的合成。刘利群等［9］在大鼠动物实验中发现川芎嗪干预组海马IL-18，IL-1 mRNA 和IL-18、IL-1蛋白的表达较惊厥组各时间点明显下调,且海马神经元变性坏死减轻,神经病理半定量积分下降的趋势与IL-18，IL-1表达下调趋势一致,提示川芎嗪对脑损伤的保护机制。某些细胞因子如IL-1受体在中枢神经系统有较高水平表达且以海马密度最高［10］。细胞因子调节免疫、神经的平衡,从而维持机体的内环境稳定及神经系统正常兴奋性。川芎嗪影响IL-1R在皮层和海马的表达与癫痫状态下神经系统兴奋性改变有关。本研究结果提示,川芎嗪的抗痫作用可能与IL -1R在皮层和海马部位的功能改变有关。致痫前给予川芎嗪大鼠,在随后的行为观察(癫痫发作潜伏期及持续时间) 及脑电图记录中,即刻发生了变化,这一时间不足以产生传统的细胞内信使转录及随后的蛋白表达系统对细胞功能的影响, 而极可能涉及川芎嗪的快速效应。后者在免疫组化研究中也得到进一步证实。致痫前给予川芎嗪大鼠,皮层和海马神经元IL-1R表达及阳性细胞着色均较癫痫组大鼠减少或减弱。其意义在于, IL-1R 是重要的免疫调节因子, 川芎嗪通过IL-1R对中枢神经系统免疫反应的调节,维持免疫、神经的平衡,抑制癫痫发作。其次，至于致痫后给予川芎嗪大鼠,上述各项指标与癫痫组相比无显著差异,可能与其应用时限有关,本组川芎嗪在癫痫发作较长时间(45 min)后给予,限制了其抗癫痫作用的发挥。川芎嗪和IL-1R 作为免疫、神经的重要调节因子在维持神经系统兴奋性方面具有重要作用。对此的进一步研究不仅有利于在受体、信使、基因水平上揭示癫痫发病机制,而且将推动非镇静类抗癫痫药物的开发。芎川嗪是中药川芎的有效成分,货源广阔,价格颇廉,临床应用剂量安全范围宽,且无明显的副作用,其对癫痫的作用具有良好的应用前景,值得更进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］ZHU Xiaoxin,LI Zhengli,ZHU Changgen,et al.Changes in Behavior and Amino Acid Neurotransmitters in the Brain of Rats with Seizure Induced by IL-1 or IL-6［J］.Journal of Huazhong University of Science and Technology （Medical Sciences）,2005,25(3):236.
       
       ［2］朱晓琴，李正莉，朱长庚，等. IL-1β或IL-6对大脑皮质星形胶质细胞细胞周期的影响［J］.神经解剖学杂志，2005，21（3）：313.
       
       ［3］朱晓琴,李正莉，朱长庚，等.IL-1β或IL-6致痫大鼠脑内γ-氨基丁酸和谷氨酸免疫反应性的变化［J］.解剖学报，2005，36（6）:586.
       
       ［4］朱晓琴等,张端莲，胡祁生，等.川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元内c-fos表达的影响［J］.武汉大学学报（医学版），2002, 23 (4):125.
       
       ［5］朱晓琴等, 胡祁生，张端莲，等.川芎嗪对大鼠癫痫放电的影响［J］.青海医药杂志，2002, 32(9):1.
       
       ［6］Diehl RG, Smialowski A, Gotwo T. Development and persistence of kindled seizures after repeated injections of pentylenetetrazol in rats and guinea pigs［J］.Epilepsia, 1984,25(4): 506.
       
       ［7］Zahorodna A , Tokarski K,Bijak M. Electrophysiologic tests for testing the effects of antidepressant drugs and corticosterone on reactivity of serotonin receptors in the hippocampus［J］.Postepy HigMed Dosw ,2000 ,54 :391.
       
       ［8］吕洋,沈维高,刘国辉.脑缺血再灌注损伤中IL-1β的作用及机制［J］.北华大学学报(自然科学版)，2004 ,5 (6):524 .
       
       ［9］刘利群,毛定安. IL-18 与中枢神经系统疾病［J］.国外医学·生理病理科学与临床分册,2005 ,25 (1) :68.
       
       ［10］ Lucassen PJ ,Muller MB ,Holsboer F ,et al. Hippocampal apoptosisin major depression is a minor event and absent from subareas at risk for glucocorticoid overexposure［J］. Am J Pathol ,2001 ,158：453.