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       【摘要】 
       目的研究机械化学法辅助提取刺五加总黄酮的最佳工艺。方法以总黄酮提取率为考察指标，通过单因素及正交实验考察机械化学法辅助提取刺五加总黄酮的主要影响因素，确定最佳工艺条件；采用分光光度法测定总黄酮含量。结果最佳工艺条件为：Na2CO3/Na2B4O7助剂用量4%（W/W），物料粒度D95 ≤37 μm，乙醇浓度为20%（V/V），料液比为1∶60（g∶ml）。该工艺条件下，总黄酮提取率比热回流法提高13.2%。结论机械化学法辅助提取具有提取率高，时间短，无需加热，乙醇用量少等特点，是提取刺五加总黄酮的一种有效方法。
       【关键词】  机械化学法辅助提取 刺五加 总黄酮 正交实验
       Optimization of the Mechanochemical Assisted Extraction of Total Flavonoids from Eleutherococcus senticosus
       LIU Ying,    JIN Liji,XU Yongping*,SONG Chunna,WANG Xiaoyan
       (Department of Bioscience and Biotechnology, State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian, 116024, China)
       Abstract:ObjectiveTo optimize the mechanochemical assisted extraction on the total flavonoids from Eleutherococcus senticosus. Methods The optimum extraction parameters were investigated by one-factor experiment and orthogonal design. The content of total flavonoids was determined by spectrophotometry. Results The optimum parameters were as follows: Na2CO3/Na2B4O7 content 4% (W/W), particle size D95 ≤37 μm, 20% (V/V) ethanol, solid/liquid ratio 1∶60 (g∶ml). Under these parameters, the total flavonoids yield increased by 13.2% compared with heat-reflux extraction. ConclusionThe mechanochemical assisted extraction can improve the total flavonoids yield, shorten the extraction time, reduce the ethanol consumption, and need no heat. It is an effective method for total flavonoids extraction from Eleutherococcus senticosus.
       Key words:Mechanochemical assisted extraction;   Eleutherococcus senticosus;   Total flavonoids;   Orthogonal design
       传统中药刺五加在中医临床上的应用已有悠久的历史，其中的黄酮类化合物具有广泛的药理活性［1］。黄酮类物质的传统提取法如煎煮、浸渍及热回流法等［2，3］，存在周期长，溶剂用量大的弊端。近些年随着科技的发展，各学科相互渗透，一些新技术已引入黄酮提取的研发中［4，5］。
       机械化学（mechanochemistry）最早发源于同生理机能有关的生物化学中机械运动能与化学能的转变，目前主要指通过挤压、剪切、摩擦等手段，对物质施加机械能，从而诱发其物理化学性质变化，使物质与周围环境中的固体、液体、气体发生化学变化的现象［6］。随着机械行业的发展，各种高能研磨设备的不断出现使机械化学在金属合金化［7］、有机合成［8］、化合物改性等［9，10］多个领域得到应用。利用高强度研磨产生的机械化学效应［11］，将植物原料与化学助剂共同研磨，作为提取的预处理，则是机械化学的一项新的应用。研究表明，高强度研磨在破碎植物细胞的同时还能促进暴露出的有效成分与助剂接触、反应，改变成分溶解性［12，13］，如Korolev等［12］将Na2CO3与松针共同研磨，用水提取三萜酸，提取率比常规法高35.9%；Lomovsky等［13］将蔗糖与伪泥胡菜共同研磨，显著提高了其中植物蜕皮类固醇在水中的溶出率。可见，机械化学法不仅能提高提取率，还实现了用极性溶剂（水）提取，有助于降低提取成本。目前，国内关于机械化学用于中药提取的研究尚未见报道。本研究主要为了考察机械化学法辅助提取各工艺条件对刺五加总黄酮提取率的影响，通过正交实验优化提取工艺，并与热回流提取对比。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器
       WZJ(BFM)-6J振动研磨机（济南倍力粉技术工程有限公司）；TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FD-ID冷冻干燥机（北京博医康仪器有限公司）；标准分样筛（河南新乡康达新机械有限公司）；LS100Q激光粒度仪（美国Beckman Coulter公司）。
       1.2  材料
       刺五加根及根茎（购自大连开发区大药房，产地吉林，按照《中国药典》鉴定［14］）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  机械化学法辅助提取
       2.1.1  助剂的选择
       刺五加中黄酮类物质主要为槲皮素及其相关的黄酮苷类化合物［15］，该类黄酮分子中含有酚羟基，呈酸性，可被碱中和，成盐，使水溶性增加，在常规操作中常采用碱水加热提取［16，17］。另外，由于此类黄酮分子中的邻二酚羟基结构易被碱破坏，与碱作用时需加硼酸盐保护［18］。根据上述性质，本研究选用Na2CO3/Na2B4O7（1∶1，W/W）为助剂与刺五加共同研磨。
       2.1.2  供试品溶液制备
       用小型中药粉碎机将刺五加药材粉碎至60目，60 ℃下干燥3 h备用（即粗粉，以下同）。取粗粉200 g与一定量助剂（Na2CO3/Na2B4O7，1∶1，W/W）混合研磨。精确称取研磨后的粉末5.0 g（按生药计），加入一定量溶剂，室温（20 ± 3 ）℃搅拌一段时间，离心，取上清，沉淀重复提取2次，合并上清液，用稀盐酸调节pH值为4.0，静置过夜，离心，取沉淀，干燥并研碎后加入20 ml，95%乙醇，超声充分溶解，过滤，滤液作供试品溶液。提取工艺如图1所示。
       2.1.3  单因素实验
       分别考察助剂用量、物料粒度（D95 ≤）、乙醇浓度、料液比及提取时间对机械化学法辅助提取刺五加总黄酮的提取率的影响。助剂用量（占总物料干重）采用1，2，4，6，8，10%（W/W）6个水平；物料粒度采用D95 ≤125，74，44，37 μm，4个水平；乙醇浓度采用0%（水），20，40，60，80%（V/V）5个水平；料液比采用1:10，1:30，1:50，1:70，1:100（g:ml），5个水平；提取时间采用3，5，10，20，30 min，5个水平。试验条件：Na2CO3/Na2B4O7用量4%（占总物料干重），粒度D95 ≤44 μm，水作溶剂，料液比1∶50（g∶ml），搅拌20 min。在其他条件不变的情况下，改变其中一个因素探讨其对总黄酮提取率的影响。
       2.1.4  正交实验
       根据单因素试验结果，作L9(34)正交设计，因素水平表见表1。表1  正交设计因素水平（略）
       
       2.2  其他提取方法供试品溶液的制备
       2.2.1  超微粉碎辅助提取
       取刺五加粗粉200 g研磨至粒度D95 ≤44 μm。精确称取研磨后的粉末5.0 g，加入250 ml，75%乙醇，室温（20 ± 3 ）℃搅拌20 min，离心，取上清液，沉淀重复提取2次，合并上清液并浓缩，得浸膏，真空干燥，研碎后加入20 ml，95%乙醇，超声充分溶解，过滤，滤液作供试品溶液。
       2.2.2  物理混合样品的提取
       取超微粉碎后的刺五加粉200 g（D95 ≤44 μm）与8.33 g Na2CO3/Na2B4O7（占总物料干重的4%，粒度D95 ≤44 μm）均匀混合，精确称取混合后的粉末5.0 g（按生药计），直接提取，过程同“2.1.2”项。
       2.2.3  热回流提取
       精确称取刺五加粗粉5.0 g,用250 ml，75%乙醇回流2 h，离心，取上清，沉淀重复提取2次，合并上清液并浓缩，得浸膏，真空干燥，研碎后加入20 ml，95%乙醇，超声充分溶解，过滤，滤液作供试品溶液。
       2.3  含量测定
       2.3.1  标准曲线的建立
       精密称取120 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品11.3 mg，2.0 ml无水乙醇溶解，转入50 ml量瓶中,用95%乙醇稀释至刻度摇匀,即得对照品液（0.226 mg/ml）。精密吸取该液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 ml，分别置25 ml容量瓶中,加水至6 ml,加5%（W/W）NaNO2试液1.0 ml,放置6 min,加10%（W/W）Al(NO3)3试液1.0 ml，放置6 min，加5%（W/W）NaOH试液10 ml,加水定容至刻度,摇匀,放置15 min以上，以相应试剂作空白，于500 nm处测定吸光度。重复测定3次，以黄酮质量(m)与吸光度(A)进行线性回归，得回归方程为A=0.4717 m-0.009 6，r= 0.999 3，在0～1.243 mg范围内呈线性关系。
       2.3.2  分光光度法测定总黄酮含量
       准确吸取供试品溶液2.0 ml，置25 ml容量瓶中,按“2.3.1”项的方法，自“加水至6 ml”起依法测定其吸光度，与标准曲线对照得黄酮质量，提取率按下式计算：
       E% = m/M × 100%
       E% ——提取率；
       m ——经换算后提取液中黄酮质量（mg）；
       M—— 样品质量（mg）。
       2.3.3  精密度实验
       精确量取供试品溶液5份，按“2.3.2”项方法分别测定总黄酮含量，RSD为1.23%，表明该检测方法精密度良好。
       2.3.4  回收率实验
       精确量取已知含量的供试品溶液5份各1 ml，分别加入1 ml对照品溶液，按“2.3.2”项方法分别测定总黄酮含量，回收率均在92.7%～102.0%之间，平均回收率96.1%，RSD为0.96%。
       2.4  统计学方法
       实验数据采用±s表示，用SPSS 10.0统计软件单因素方差分析，S-N-K检验处理。
       3  结果与讨论
       3.1  不同预处理方法对总黄酮提取率的影响。结果见表2。表2  不同预处理方法对总黄酮提取率的影响（略）
       刺五加与Na2CO3/Na2B4O7共同研磨后以水为溶剂的提取率比超微粉碎（75%乙醇作溶剂提取）提高15.4%（P<0.05）。物理混合样品的助剂用量、物料粒度、溶剂等条件均与机械化学法相同，但总黄酮提取率却显著低于后者（P<0.05），这表明机械研磨在促进Na2CO3/Na2B4O7与黄酮类物质的接触、反应，提高黄酮水溶性方面可能起到重要作用。
       3.2  单因素实验
       3.2.1  助剂用量对提取率的影响 见图2。
       助剂的最小用量主要取决于机械化学过程的传质速率及目标提取物的性质，如提取松针三萜酸时，为使三萜酸与碱充分作用，Na2CO3的最小用量为3%（W/W）［8］。由本实验结果可知，当Na2CO3/Na2B4O7用量大于4%（W/W）后，总黄酮的提取率趋于平衡（P>0.05）。这表明在本实验条件下，添加8.33 g Na2CO3/Na2B4O7（占总物料干重的4%）即可使刺五加中的黄酮类物质与碱充分作用。
       3.2.2  物料粒度对提取率的影响 见图3。
       随研磨时间延长，物料粒度减小，助剂与目标提取物接触、作用时间越长。粒度由D95 ≤125 μm减小至44 μm，总黄酮的提取率提高了64.4%（P<0.05）。当粒度（D95 ≤）小于44 μm后，提取率无显著提高（P>0.05）。故物料粒度选用D95 ≤44 μm。
       3.2.3  乙醇浓度对提取率的影响 见图4。
       机械化学法处理后，刺五加总黄酮在水和稀醇溶液（20%，40%乙醇）中的提取率最高（平均为1.68%），随乙醇浓度增加，提取率逐渐降低（P<0.05）。这表明机械化学法可提高刺五加总黄酮在极性溶剂中的溶解性，进而可用水或稀醇提取。
       3.2.4  料液比对提取率的影响 见图5。
       随溶剂用量增大，总黄酮提取率增加，当料液比小于1∶50（g∶ml）后，提取率增加幅度不明显（P>0.05），考虑生产成本和后续处理，料液比取1∶50（g∶ml）。
       3.2.5  提取时间对提取率的影响
       见表4。表4   提取时间对提取率的影响（略）
       机械化学处理后，刺五加总黄酮可快速溶出。在3～30 min内，随提取时间延长，总黄酮提取率变化不大（P>0.05），故提取时间的选取可根据实际操作要求而定。
       3.3  正交实验
       根据以上单因素实验的结果，选择L9(34)表，实验方案及计算结果见表5。表5  L9(34)正交实验结果（略）
       由级差分析可知，机械化学法辅助提取刺五加总黄酮的最佳工艺为A2B3C2D3，即Na2CO3/Na2B4O7助剂用量为4%（W/W），物料粒度D95 ≤37 μm，乙醇浓度为20%（V/V），料液比为1∶60（g∶ml）。各因素对提取率的影响次序为：物料粒度 > 助剂用量 > 乙醇浓度 > 料液比。
       在优化的工艺条件下进行了3批原料的平行提取，提取率分别为1.74%，1.72%，1.69%，平均提取率为1.72%。
       3.4  机械化学法辅助提取与热回流提取对比
       按正交实验确定的最佳工艺条件提取刺五加总黄酮，与热回流提取对比，结果见表6。表6  机械化学法辅助提取与热回流提取对比（略）
       机械化学法的提取率比热回流提取高13.2%，室温下操作，提取时间由2 h缩短到10 min，且以20%（V/V）稀醇作溶剂，减少了乙醇用量。
       4  结论
       本研究将机械化学法用于刺五加总黄酮的提取，最佳工艺条件为Na2CO3/Na2B4O7助剂用量为4%（w/w），物料粒度D95 ≤37 μm，乙醇浓度20%（v/v），料液比1∶60（g∶ml）。机械化学法辅助提取明显优于热回流法，提取率提高13.2%，大大缩短提取时间，减少了乙醇用量，无需加热，操作简便，是提取刺五加总黄酮的一种有效方法。本研究为机械化学法在中药提取中的应用提供了参考。
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