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       【摘要】 
       目的探讨开口箭、筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用机制。方法以康华酒友解酒晶作为对照，采用白酒灌胃造模，分别检测给药组和对照组小鼠肝脏乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase, ADH）、乙醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）活力。结果开口箭、筒鞘蛇菰提取物及复方组ADH，ALDH，SOD，GSH-Px活力均比模型对照组要高，具有统计学意义。结论开口箭、筒鞘蛇菰提取物可以提高ADH，ALDH，SOD，GSH-PX的活性，加快乙醇在体内的代谢，减少自由基在体内的蓄积，降低脂质过氧化物的含量，从而起到保肝护肝的作用。
       【关键词】  开口箭 筒鞘蛇菰 乙醇脱氢酶 乙醛脱氢酶 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶
       Mechanism for the Extracts of Tupistra chinensis Bak. and Balanophora involucrata HK.f. to Inhibit Alcoholism
       TANG Zichun, ZOU Kun*, WANG Junzhi, YIN Chuanzhong, LU Haihua
       Hubei Provincial Key Laboratory of Natural Product Research and Development, College of Chemistry and Life Science, China Three Gorges University, Yichang,  Hubei 443002, China
       Abstract:ObjectiveTo elucidate the mechanism for the extracts of Tupistra chinensis Bak. and Balanophora involucrata HK.f. to inhibit alcoholism.MethodsThe liver injury of rats was induced by alcohol with an agent "Jiejiujing" as the control group. Then the activities of ADH, ALDH, SOD and GSH-Px in the medication administration and control group were determined. ResultsThe activities of ADH, ALDH, SOD and GSH-Px upon admitting with Tupistra chinensis Bak., Balanophora involucrata HK.f. and their mixture markedly increased in comparison with those of model groups.ConclusionThe extracts of Tupistra chinensis Bak. and Balanophora involucrata HK.f. can markedly enhance the activities of ADH,ALDH,SOD and GSH-Px.
       Key words:Tupistra chinensis Bak.;  Balanophora involucrata HK.f.;  ADH;  ALDH;  SOD;  GSH-Px
       我国是酒生产和消费的大国，随着生活水平的提高，人们对酒的需求量也不断增加。由于过量饮酒，这也就导致酒精中毒事件经常发生。如何减轻或解除酒精中毒患者的痛苦，开发出有效、安全的醒酒药成为当今医学界研究的一个热点。目前关于醒酒药研究的文章比较多，但真正从醒酒作用机制方面系统开展研究的还不多。本研究室的实验结果［1］表明开口箭正丁醇、筒鞘蛇菰醋酸乙酯提取物具有较好的醒酒效果，本实验对这两部分提取物及其复方的醒酒机制进行初步探讨。现报道如下。
       1  器材
       1.1  药材开口箭根茎采挖自湖北省神农架林区，其原植物标本于200207采自同一地区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，原植物及药材现保存于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（编号：TC200207SNJ）。
       
       筒鞘蛇菰药材采挖自湖北省神农架林区，其原植物标本于200508采自同一地区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Balanophora involucrata HK.f.，原植物及药材现保存于天然产物研究与利用湖北省重点实验室（编号：BI200508SNJ）。
       1.2  药品乙醇(工业)；39度金三星枝江大曲，湖北枝江酒业股份有限公司，批号：ZJA39001/0；康华酒友解酒晶，洛阳康华生物制品有限公司，批号：豫卫特食字（2000）第0140号；氯化钠注射液，湖南科伦制药有限公司，批号：0050826；SOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060217；GSH-Px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060222；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20060222。
       1.3  试剂
       1.3.1  pH 8.8焦磷酸钠缓冲液1.427 g十水焦磷酸钠(Na2P2O7·10H2O)溶于蒸馏水，用1 mol·L-1 NaOH溶液将pH调至8.8，并定容到100.00 ml。
       1.3.2  乙醇底物溶液取12.12 m1浓度为95%乙醇溶于蒸馏水中，并定容至100.00 ml。
       1.3.3  乙醛底物溶液40%乙醛溶液。
       1.3.4  氧化型辅酶I溶液称取30 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，加蒸馏水并定容至10.00 ml冰箱保存。
       1.3.5  pH 7.4蔗糖缓冲溶液含5 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA, 0.25 mmol/L蔗糖。
       1.4  仪器药物粉碎机(FE130型)，河北黄骅市航天仪器厂；旋转蒸发仪，无锡市星海王生化设备有限公司；低温冷冻干燥箱，美国LABCONCO公司；ZYC-1型小鼠自主活动仪，安徽省濉溪正华教学实验器械厂；微型台式高速离心机（5415D），德国eppendof公司；U-2800紫外可见分光光度计, HITACHI公司。
       1.5  动物昆明种小鼠，雄性，体重（20±2）g，由华中科技大学同济医学部实验动物中心提供，合格证号：19～052。
       2  方法
       2.1  开口箭、筒鞘蛇菰提取物的制备开口箭、筒鞘蛇菰药材于50℃干燥过夜，粉碎，加入95%乙醇，常压回流2 h，过滤，重复操作3次，合并滤液，减压回收乙醇至小体积，冷冻干燥，得到开口箭、筒鞘蛇菰95%乙醇提取物干燥粉末。取一定量粉末水中悬浮，然后依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩成浸膏。
       2.2  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对急性酒精中毒小鼠肝中ADH与ALDH的影响取昆明种小鼠64只，随机分成8组，每组8只，分别为给药组，模型对照组，阳性对照组。小鼠禁食12 h后，给药组分别ig开口箭正丁醇部分（2.7 g·kg-1），筒鞘蛇菰醋酸乙酯部分(9 g·kg-1), 开口箭和筒鞘蛇菰复方(3∶10, 3∶20, 3∶5)；阳性对照组ig康华酒友解酒晶（1.5 g·kg-1）；模型对照组ig等量的生理盐水。30 min后各组分别ig 39度金三星枝江大曲0.017 ml·g-1 ，空白对照组ig等量的蒸馏水。酒后1 h，处死各组小白鼠，取其肝脏。将0.5 g肝脏2 ml蔗糖溶液的比例量取蔗糖溶液。肝脏先用生理盐水，后用蔗糖溶液冲洗，再放入已量好的蔗糖溶液中，在冰水浴中剪碎、匀浆，把匀浆液放入2 ml离心管中。以600 g离心10 min，以除去细胞碎片、红细胞和核；小心地取出上清液，以9 000 g再次离心10 min，得上清液用于ADH活力的测定，沉淀为线粒体，加入1 ml蔗糖, 制成悬浮液后可以进行ALDH活力的测定，整个离心操作过程保持在0～40℃温度下进行。小鼠肝组织ADH和ALDH活力的测定参照雷雨硕士学位论文［2］的方法来进行。
       2.3  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对急性酒精中毒小鼠肝中SOD和GSH-Px的影响取昆明种小鼠64只，随机分成8组，每组8只，分别为给药组，模型对照组，阳性对照组。小鼠禁食12 h后，给药组分别ig开口箭正丁醇部分（2.7 g·kg-1），筒鞘蛇菰醋酸乙酯部分(9 g·kg-1), 开口箭和筒鞘蛇菰复方(3∶10, 3∶20, 3∶5)；阳性对照组ig康华酒友解酒晶（1.5 g·kg-1）；模型对照组ig等量的生理盐水。30 min后各组分别ig 39度金三星枝江大曲0.015 ml·g-1 ，空白对照组ig等量的蒸馏水，连续灌胃5 d，最后一天灌酒后30 min，处死各组小白鼠，取其肝脏。肝组织块（0.2～1 g）用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入已洗干净的组织匀浆器中，然后按体积重量比为1∶9的比例量取预冷的生理盐水，移入组织匀浆器中，充分研磨，使组织匀浆化，然后将匀浆转移到5 ml的离心管中，2 000 r·min-1离心10 min，将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀，即得到10%肝组织匀浆，最后将其分别稀释到1%和0.25%备用。小鼠肝组织SOD和GSH-Px活力的测定参照南京建成生物工程研究所试剂盒的使用说明，分别采用黄嘌呤氧化酶法和DNTB（二硫代二硝基苯甲酸）比色法来进行。
       2.4  统计学处理采用SPSS 11.5统计软件，实验数据结果±s来表示，组间差异比较采用t检验，以P = 0.05为显著水平，判断组间是否存在差异性。
       3  结果
       3.1  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对急性酒精中毒小鼠旰中ADH和ALDH活性的影响结果见表1～2。由表1数据可知，开口箭和筒鞘蛇菰均可增强ADH的活性，并且开口箭和筒鞘蛇菰的复方（3∶10）对ADH的活性有极显著性提高（P<0.01）。开口箭和筒鞘蛇菰的复方（3∶5）也对ADH的活性有显著性提高（P<0.05）。
       由表2可知，开口箭和筒鞘蛇菰均对ALDH的活性有所提高，其中开口箭正丁醇部分效果比较明显，有统计学差异（P<0.01）, 开口箭和筒鞘蛇菰的复方（3∶20）和（3∶5）效果也较好，也有统计学差异（P<0.01）。
       3.2  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对急性酒精中毒小鼠肝中SOD和GSH-Px活性的影响结果见表3～4。由表3可知，开口箭、筒鞘蛇菰提取物及它们的复方均可以提高小鼠肝中SOD的活力，并且与模型组相比，均有极显著性差异（P<0.01）。表1  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对小鼠肝中ADH活性的影响（略）表2  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对小鼠肝中ALDH活性的影响(略）表3  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对小鼠肝中SOD活性的影响(略）表4  开口箭、筒鞘蛇菰提取物对小鼠肝中GSH-Px活性的影响(略）
       
       表4数据表明，开口箭、筒鞘蛇菰提取物及它们的复方均可以提高小鼠肝中GSH-Px的活力，其中开口箭正丁醇部分以及筒鞘蛇菰乙酸乙酯部分与模型组相比，均有极显著性差异（P<0.01）；开口箭和筒鞘蛇菰的复方（3∶10）与模型组相比，有显著性差异（P<0.05）。
       4  讨论
        医学研究证明［3～5］，乙醇在人体内由消化道吸收，主要要由肝脏代谢，在生理条件下大部分乙醇经ADH代谢为乙醛，乙醛又经ALDH氧化生成乙酸，再经三羧酸循环氧化成CO2和水，最终排出体外。由此可见，乙醇代谢的过程中两个关键酶就是体内ADH和ALDH。二者活力的高低决定了乙醇代谢的速度。另外，大量饮酒后，酒在人体内会产生大量的氧自由基和脂质过氧化物而对机体产生毒害作用。SOD是机体内清除氧自由基的重要酶之一［6,7］，主要是清除体内具有毒性的超氧阴离子，阻断活性氧所引发的一系列自由基反应加剧，保护细胞免受其氧化毒害。若SOD的活性降低，则可导致自由基在人体内蓄积，过量的自由基又与生物膜中多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生大量的脂质过氧化物，破坏生物膜的正常结构和功能，造成肝组织细胞损伤。而GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化物分解的酶［8］，它在细胞内能阻断脂质过氧化物的产生，又可使脂质过氧化物分解成相应的醇类，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。因此，提高ADH和ALDH的活性，可以加快乙醇在体内的代谢速度；增强SOD和GSH-Px的活性，可以清除体内的自由基，保护细胞膜的结构和功能，减轻肝组织的损伤。
       在ADH和ALDH活力测定实验中，开口箭、筒鞘蛇菰提取物及复方组与模型组相比，活力要高，并且有统计学意义，这就揭示开口箭和筒鞘蛇菰可以提高ADH和ALDH的活性，加快乙醇的代谢速率，降低乙醇在体内的生物利用度，减轻乙醇代谢产物对肝组织的损伤。在SOD和GSH-Px活力测定实验中，开口箭和筒鞘蛇菰提取物组SOD和GSH-Px活力明显比模型组要高，并且有显著性差异，这就说明开口箭和筒鞘蛇菰增强SOD和GSH-Px的活性，减少自由基在体内的蓄积，阻断脂质过氧化物的产生，从而起到保肝护肝的作用。
       【参考文献】
         　　［1］汤子春, 邹坤, 汪鋆植, 等.开口箭与筒鞘蛇菰提取物醒酒作用的实验研究［J］.时珍国医国药, 2006, 17(11): 2163.
       
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       ［3］苑隆国，李 旭，王晓辉. 护肝胶囊对人和小鼠体内乙醇脱氢酶活性的影响［J］.中国新医药，2003, 2(4): 28.
       
       ［4］汤子春,邹 坤.天然醒酒药的研究现状［J］.中草药(增刊), 2005, 11(36): 285.
       
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       ［6］彭勃, 苗明三, 王颖芳, 等.橄榄解酒饮对大、小鼠急性酒精性肝损伤模型自由基代谢的影响［J］.江苏中医药, 2004, 25(1): 55.
       
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       ［8］嵇 扬，陆 红，杨 平.枳椇子酒与枳椇子水提液解酒毒作用比较研究［J］.时珍国医国药, 2001, 12(6): 481.