文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24 h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2 ml。荔枝核水提液对小鼠S180，EAC抑瘤实验连续给药10 d。测定肿瘤作用与细胞凋亡表达。结果荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用， Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。荔枝核水提物能够明显抑制S180，EAC肿瘤的生长（P<0.05），荔枝核提取物对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤其抑瘤率达到30.62%；结论荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC体内、外细胞生长的影响，促进肿瘤细胞的凋亡，从而表现抗肿瘤的作用。
       【关键词】  荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡
       荔枝核为无患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的干燥成熟种子。夏季采摘成熟果实，除去果皮及肉质假种皮，洗净，晒干［1］。荔枝及荔枝核的经济和药用价值逐渐受到关注,近几年来已有多篇报道用荔枝核中药治疗糖尿病的经验［2］，荔枝核具有调血脂、保肝以及抗氧化等作用［3，4］，特别是荔枝核的多糖成分在抗肿瘤、提高机体免疫活性方面具有较大的关注。基于以上的研究，本实验进一步研究荔枝核对荷瘤小鼠体内、外细胞生长及诱导细胞凋亡的影响报道如下。
       1  材料
       1.1  动物清洁级 ，新西兰雄性大白兔,购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号：粤监证字2006A001。SPF级小鼠 ，购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号: 粤监证字2006A018。
       1.2  仪器CO2恒温培养箱（Thermo fora美国）；AIR TECH型医用超净台（苏净集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶标定量测试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 电泳仪（美国）；Eppendorf 低温高速冷冻离心机（德国）。
       1.3  试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒∶生药＝1∶10），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。
        环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：05010821。
       RPIM 1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料 sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)； BAX抗体（cell signaling）； BCL-2抗体（santa cruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce 批号：HI106361 ；丙烯酰胺   sigma ; 甲叉丙烯酰胺  sigma ；SDS-十二烷基磺酸钠sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20 sigma；TRIS-BASE sigma;TRIS  sigma ;脱脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN滤纸  whatman。
       2  方法
       2.1  实验技术路线
       2.1.1  离体细胞实验
       2.1.2  在体动物实验
       2.2  含药血清的制备按李仪奎等［5］方法制备含药血清：将体重约1.5 kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42 g·kg-1·d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4 g·kg-1·d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每次间隔12 h，灌药前4h禁食不禁水，连续3 d，末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4℃下静置4 h，3 000 r·min-1离心15 min，无菌分离血清经56℃，30 min灭活处理后，0.20 μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。
       2.3  MTT法检测含药血清对 HepG2细胞的抑制率取对数生长期的细胞HepG2细胞，以3×104 ml-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100 μl，让细胞贴壁生长24 h后，以不同浓度组含药血清体积比分别为10%，20%，30%作用于细胞，每组浓度设4个复孔，培养72h后分别测细胞的生长抑制率，重复3次取平均值采用,结果见图1;实验结果表明：荔枝核提取物30%含药血清高、中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用。
       2.4  Hochest33258染色检测细胞凋亡将无菌的铺有多聚赖氨酸盖玻片置于六孔板内，以4×105 ml-1细胞接种24 h后， 加入含药血清作用72h后，吸尽培养液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min后，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，边晃动边染色。抗淬灭液封片后，置荧光显微镜下观察，拍片；结果见表1；实验结果表明：其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态。 表1  荔枝核提取物含药血清作用HepG2细胞72h的OD值(略)
       2.5  流式细胞仪测定凋亡率取对数生长期的HepG2细胞，以4×105 ml-1到25 ml玻璃培养瓶，待其贴壁生长24 h后，加药72 h后，胰酶消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用冷PBS洗涤两次，将细胞重悬于70%的冰乙醇固定24 h，离心弃乙醇，PBS洗涤1次，滴加已配好的200μl·ml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，离心弃上清液，PBS洗涤1次，加0.5ml碘化丙锭（PI），过夜，离心弃PI，再用PBS洗涤1次，立即上机；结果见图2和表2; 而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。
       2.6  肿瘤模型的建立
       2.6.1  小鼠S180，EAC移植性肿瘤模型［6］无菌抽取接种7 d后小鼠腹水,加生理盐水稀释使细胞密度达到2×106·ml-1于每只小鼠右前肢腋窝处皮下常规接种一肿瘤细胞悬液0.2 ml，制成局灶性实体瘤模型。
       2.6.2  动物分组及处理接种24 h后,随机分成空白组、阳性对照组（CTX）、荔枝核高中低剂量组，每组10只。空白组以0.1ml·（10 g）-1灌胃给以生理盐水，阳性对照组CTX 25 mg·kg-1·d-1，荔枝核高剂量组62 g·kg-1·d-1，荔枝核中剂量组31 g·kg-1·d-1，荔枝核低剂量组15.5 g·kg-1·d-1。灌胃给药1次/d，连续9 d，于第10天，将各组小鼠称体重后处死,完整剥离瘤块并称重，按照公式:(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)100%/对照组平均瘤重,计算抑瘤率。结果（见表3～4）。实验结果表明：荔枝核提取物对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑瘤作用，主要是高剂量组表现明显，其抑瘤率达到30.62%；对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。
       2.7  Western blot 方法 检测bcl-2 ,bax含量的表达［7］按试剂盒说明，提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。
       2.7.1  蛋白电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制：
       ①12%分离胶： 双蒸水 3.35 ml;  1.5 mol/L Tris ( pH=8.8 ) 2.5 ml;  30%丙烯酰胺 4 ml；10%SDS  0.1 ml；10%过硫酸胺 50 μl；TEMED  5 μl (临用前加入)；
       ②5%浓缩胶： 双蒸水 3.4 ml;  0.5 mol/L Tris ( pH=6.8 ) 0.625  ml；30%丙烯酰胺 0.850 ml；10%SDS  0.05 ml；10%过硫酸胺 50 μl；TEMED  5 μl (临用前加入)。
       2.7.2  操作步骤①按说明书装好电泳槽及玻璃板，同时做2块胶，一块染色，一块转膜；②确定所需凝胶的体积，按分离胶的配方依次混合各种成分，一旦加入TEMED后马上开始聚合，故应该立即旋动混合物； ③迅速在2块玻璃板的间隙中小心注入丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶的所需空间，并快速在胶的上方加满双蒸水，放置30min后用滤纸小心吸净双蒸水，用笔记录分离胶的上缘；④按浓缩胶的配方制备浓缩胶，加入TEMED后，立即快速旋动混合物；⑤在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，小心避免混入气泡，室温下放置15 min；⑥小心拔出梳子，按电泳装置的要求进行安装，加样70 ug/孔；⑦电泳，浓缩胶中以80 V电泳约15 min，在溴酚蓝跑到接近分离胶时改电压为120 V，再继续电泳约75 min；⑧电泳结束后，小心把胶从2块玻璃中剥离出来，放入考马斯蓝染色液中，30 min后拿出，放入脱色液中直至背景褪色，蛋白条带清晰为止。表2  荔枝核含药血清对 HepG2细胞凋亡的影响结果（略）表3  荔枝核提取物对小鼠EAC实体瘤生长抑制作用(略)
         
       2.7.3  蛋白的电转移、抗体孵育和显影①转膜：戴手套切6张滤纸和1张NC膜，大小与凝胶完全一致，并置于转移缓冲液中浸泡30 min。将3层滤纸、NC膜、凝胶、3层滤纸的顺序排好，使之完全对齐，精确重叠，层间不留气泡，并用铅笔在一角做标记。按黑色板夹子→海绵垫→3层滤纸→凝胶→NC膜→3层滤纸→海绵垫→透明夹子的顺序固定好，按红黑方向放置于转移槽中，往槽中加满转移缓冲液，接通电源，4℃，80 V转移120 min，然后中止电源，取出NC膜进行杂交，并将凝胶转至考马斯亮兰染料中进行染色，检测蛋白是否转移完全。转印完毕将NC膜分为3块，分别用TBST洗膜3次，10 min/次；② 封闭：用含有5%脱脂奶粉TBST 封闭放置于脱色摇床上，室温反应120 min，并用TBST缓冲液将NC膜洗3次，10 min/次；③一块用一抗anti-bcl-2，（1∶100TBS-5%milk-0.1%Tween20稀释），一块用anti-bax（二抗用羊抗兔），一块用anti-GAPDH（二抗用羊抗鼠）（1∶1000TBS-5%milk-0.1%Tween20稀释）4℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，10 min/次；④分别用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠二抗IgG-HRP，室温缓慢震荡1 h后，TBST洗膜3次，每次10min；⑤将Westernblot化学荧光试剂A，B各500 μl等量混合后，于暗房，均匀加至膜上反应3 min，X光片曝光，凝胶图像分析仪扫描图像。表4   荔枝核提取物对小鼠S180实体瘤生长抑制作用(略)
       
       通过Western blot分析，结果见图3～4，荔枝核对小鼠S180EAC细胞生长其抑瘤作用主要是通过促进促凋亡蛋白bax的表达，减少抑制凋亡蛋白bcl2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，而表现抗肿瘤作用。
       3  结果
       荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用，（见表1），其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。
       
       荔枝核提取物对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑瘤作用，主要是高剂量组表现明显，其抑瘤率达到30.62%；对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。通过Western blot分析，其抑瘤作用主要是通过促进促凋亡蛋白bax的表达，减少抑制凋亡蛋白Bcl 2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，而表现抗肿瘤作用。
       4  讨论
           
       本实验利用荔枝核对S180，EAC实体瘤经重复3次实验,结果一致，表明荔枝核对S180，EAC实体瘤小鼠的肿瘤生长有一定的抑瘤作用（P<0.05～0.01），结果（见表1～4），与文献报道一致［6］。
       荔枝核“行气散结，祛寒止痛。用于寒疝腹痛，睾丸肿痛”也证实动物体内荔枝核对小鼠S180，肝癌有一定的抑制肿瘤作用［6］。Purmova等［8］研究表明，荔枝以及人参、柴胡、大豆、黄芪等皂苷对心脏功能发挥直接作用或有助于治疗相关疾病，如抑制心肌或肝脏脂质过氧化物的形成及影响心肌或肝脏酶的功能，调整血液凝固、降低胆固醇和血糖水平，或刺激免疫系统、推断皂苷是一组有希望防治心脏和系统疾病的天然化合物。
       荔枝核水提液既能降低正常小鼠的血糖又能降低四氧嘧啶(ALX)所致小鼠的高血糖［9］。钟鸣等［10］观察了荔枝口服液对ALX-DM大鼠降血糖作用25 g·kg-1灌胃2周后，病鼠空腹血糖水平明显下降至接近正常对照组，与3 g·kg-1的甲苯磺丁脲相当;空腹血清胰岛素含量高于服药前和模型组1倍,但仅为正常对照组的三分之一,说明荔枝口服液在一定程度上能提高糖尿病大鼠血清胰岛素的含量。这可能与荔枝核抗氧化、保护或促进受损胰腺β细胞修复作用有关。肖柳英等［11］实验证明，荔枝核（41.6和20.8 g·kg-1）能明显降低卡介苗加脂多糖致免疫性肝炎以及硫代乙酰胺(TAA)和四氯化碳（CCl4）诱导急性肝损伤模型小鼠的血清丙氨酸氨基转氨移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性和丙二醛（MDA）含量，提高血清超氧化物歧化酶（SOD）活性和总蛋白、白蛋白含量。
       荔枝核提取物能改变实验性2型糖尿病（T2DM）伴胰岛素抵抗（IR）模型大鼠血糖、血脂、胰岛素、胰岛素敏感指数（ISI）、痩素、肿瘤坏死因子-α（TNF- α）等指标，纠正T2DM伴IR大鼠胰岛素抵抗相关脂肪细胞因子，改善糖、脂代谢紊乱，增强胰岛素敏感性［12］。徐庆等［13］检测荔枝核提取物A，B，C，D，E和F（200和100 mg·L-1）对HePG2，2，15细胞HBsAg与HBeAg表达的影响，结果显示，荔枝核提取物A，B，C，D，E和F在200和100 mg·L-1浓度下对HBsAg和HBeAg表达均有抑制作用，其中以E成分作用最强，在200 mg·L-1浓度下，实验第3天对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为50%和20%，实验第9天分别达到90%和84.3%, 证明荔枝核提取物体外有较强的抗乙肝病毒作用。肖柳英等［14］观察荔枝核对治疗48例慢性乙型肝炎疗效临床研究，用荔枝核治疗6个月，观察肝功能、肝纤维化、B超等指标结果，治疗4周后治疗组乏力、纳差、腹胀、肝区不适等有改善。治疗12周后，ALT，A，TBiL有改善，AST，G有明显的改善，治疗24周后，HA，LN，PCⅢ，IV-C有明显的改善，并有降低血脂，胆固醇、甘油三酯的作用。
       
       荔枝核中具有药理活性的主要有效部位是黄酮类化合物和总皂苷。黄酮、异黄酮及皂苷是具有多种生物活性和药理作用的化合物，它们的作用涵盖了清除自由基、抗氧化、抗感染 、抗过敏、抗菌 、抗病毒、抗糖尿病、抗骨质疏松、抗血栓、抗致癌物质、抑制增生、保护肝脏、保护心血管等多个方面，对治疗和预防肿瘤 、衰老、心血管疾病具有重要意义［15，16］。
       
       综上所述，本实验是利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长的作用；通过建立小鼠S180，EAC移植性肿瘤模型，观察其体内抑制肿瘤的作用，采用分子生物学的方法初步探讨荔枝核诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC体内、外细胞生长的影响；促进肿瘤细胞的凋亡，从而表现抗肿瘤的作用。利用荔枝核继续深入开展有效成分研究,作为肿瘤抑制剂应用于肿瘤临床治疗的辅助剂提供有意义的依据。是否能用于治疗抗肿瘤其确切机制尚有待进一步的研究。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005：169.
       
       ［2］American Diabetes Association Roport of the expert committee ondiagnsis and classification of dabetes mellitus［J］.Diabetes Care,1997,20(7)：1183.
       
       ［3］潘竞锵,刘惠纯,刘广南,等.荔枝核降血糖、调血脂和抗氧化的实验研究［J］.广东药学,1999,9(1):47.
       
       ［4］肖柳英,潘竟锵,饶卫农,等.荔枝核颗粒对小鼠肝损伤保护作用的实验研究［J］.中华中医药杂志,2005,20(1):42.
       
       ［5］李仪奎,吴健宇.血清药理实验中采血时间的通法方案［J］.中国药理学通报,1999,15(6)：569.
       
       ［6］肖柳英,张 丹，冯昭明，等.荔枝核对小鼠抗肿瘤作用研究［J］.中药材，2004，27（7）：517.
       
       ［7］王海燕，蔡 兵，崔承彬，等.蔓荆子活性成分Vitexicarpin诱导K562细胞凋亡的机制［J］.药学学报，2005，40（1)：27.
       
       ［8］Purmova J, Ooletal L. Phytotherapeutic aspects of diseases of the cardiovascular system. 5. Saponins and possibilities of their use in prevention and therapy［J］.Ceska Slov Farm, 1995,44(5)：246.
       
       ［9］潘竞锵,郭洁文，韩 超，等.荔枝核的药理实验研究［J］.中国新药杂志，2000，9（1）：14.
       
       ［10］钟 鸣，张树球，梁德乾，等.荔枝口服液对糖尿病大鼠降血糖作用的观察［J］.右江民族学院学报，1996，18（3）：303.
       
       ［11］肖柳英,潘竟锵,饶卫农,等.荔枝核对小鼠免疫性肝炎及肝损伤作用研究［C］.中国中医药学会广州分会，2004年中医学术年会论文汇编，2004：276.
       
       ［12］郭洁文，潘竞锵,邱光清.荔枝核增强2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性作用［J］.中国新药杂志，2003，12（7）：526.
       
       ［13］徐 庆，陈全斌，义祥辉，等.荔枝核提取物对 HePG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响［J］.中国医院药学杂志，2004，24（7）：393.
       
       ［14］肖柳英，曾文铤，马佩球，等.荔枝核颗粒剂治疗慢性乙型肝炎疗效研究［J］.中华中医药杂志，2005，20（7）：444.
       
       ［15］MIDDLETON FJR,KANDASWANMI C, Heainaridis TC. The impact of plant flavonoids on mammalian biology: implications for inflammations, heart disease and cancer［J］.Pharmacol Rev, 2000,52(4)：673.
       
       ［16］WANG HK. The therapeutic polential of flavonoids［J］.Expert Opin Inrestig Drugs, 2000,9(9)：2103.