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       【摘要】 
       目的建立反相高效液相色谱法同时测定石榴皮中乌索酸和齐墩果酸的含量，并进行方法学考察。方法色谱柱为Kromasil C18分析柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-水-磷酸(88∶12∶0.1)，流速0.8 ml·min-1，光电二极管阵列检测器（PAD），检测波长210 nm，柱温28 ℃。结果在选定色谱条件下线性范围良好，乌索酸和齐墩果酸的样品加样回收率分别为99.3%和98.5 %，RSD为2.20%和1.78%。结论方法测定快速，结果准确、可靠，可用于石榴皮中乌索酸和齐墩果酸含量的定量分析。
       【关键词】  石榴皮 高效液相色谱法 乌索酸 齐墩果酸 光电二极管阵列检测器
       Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Cortex Granati by RPHPLC
       LIU Hong, CHEN Liang, ZOU Shengqin*
       (Yichun College,Yichun, Jiangxi 336000,China）
       Abstract:ObjectiveTo develop a quantitative method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati by RP-HPLC.MethodsHPLC with photodiode array detector (PAD) was carried out on Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 28℃ using methanol-water- phosphoric acid (88∶12∶0.1) as mobile phase with a flow rate of 0.8 ml·min-1 and detected wavelength was at 210 nm.ResultsThe good linear relationship was obtained under the optimum conditions. The recoveries of the standards added for ursolic acid and oleanolic acid were 99.3% and 98.5%, respectively, while the relative standard deviations was 2.20 % and 1.78%. ConclusionThe method is rapid and precise.It can be used to determine the ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati.
       Key words:Cortex Granati;  HPLC;  Ursolic acid;  Oleanolic acid ;   Photodiode array detector
       石榴皮是石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，味酸、涩，性温，具有涩肠止泻、止血、驱虫之功效，可用于久泻、久痢、便血、虫积腹痛等的治疗，为历版《中国药典》所收录，含量测定项以鞣质为定量标准［1］。石榴皮含多种化学成分，如没食子酸、石榴皮亭A、石榴皮亭B、鞣云实精、鞣花酸、安石榴林等［2］。安明等［3］研究了石榴中乌索酸的最佳提取工艺条件，并按《中国药典》1995年版Ⅰ部山茱萸项下方法测定了石榴中乌索酸的含量，但石榴皮中乌索酸和齐墩果酸的成分鉴定研究和含量测定均未见文献报道。本实验采用反相高效液相色谱法同时测定了石榴皮中乌索酸和齐墩果酸的含量，并进行了定性鉴别，为药材的质量控制和评价提供实验依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器  
       高效液相色谱仪（515型泵，2996光电二极管矩阵检测器，柱温箱，Empower中文色谱工作站，美国）； CP225D分析天平（德国Sartorius公司）；KS-1500超声提取仪器(宁波科盛仪器厂)。
       1.2   试药 
       甲醇，色谱纯（上海陆忠试剂厂）；95 %乙醇，分析纯（江西同盟试剂厂）；水为高纯水；乌索酸和齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110742-200314、110709-200304，供含量测定用)。石榴皮，市售。
       2  方法与结果
       2.1  检测波长的选择取对照品和石榴皮样品溶液进样，使用PAD检测器在190～600 nm波长范围进行光谱扫描，流动相中乌索酸和齐墩果酸的紫外光谱吸收特征一致，最大吸收波长均为202.2 nm (见图1)。为了消除流动相在短波长处的末端干扰，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210 nm为检测波长时信噪比高，基线平稳。
       2.2  色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水-磷酸（88:12:0.1）；检测波长：210 nm；流速：0.8 ml/min；柱温：28℃；进样量：20 μl。外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸分离度为1.95，理论塔板数均大于13 000。乌索酸、齐墩果酸对照品和石榴皮样品溶液色谱见图2。
       2.3  峰纯度分析采用Empower色谱软件适应性模块对此波长的色谱峰进行纯度分析，对照品和样品中乌索酸和齐墩果酸色谱峰的纯度角值均小于阈值，纯度角线均位于自动阈值线下方，证实色谱峰为单一组分吸收率。乌索酸和齐墩果酸的色谱峰纯度分析见图3。
       2.4  溶液配制
       2.4.1  对照品溶液 
       分别精密称定乌索酸、齐墩果酸对照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品混合溶液，备用。
       2.4.2   石榴皮样品溶液精密称取约5 g烘干的石榴皮（粉碎过80目筛）置具塞三角烧瓶中，分别加入40 ml乙醇超声提取90 min，过滤，滤渣用乙醇洗涤2次，合并滤液，转移至50 ml容量瓶中，定容。滤液离心后用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液作为样品溶液。
       2.5   线性关系考察分别精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液中1，4，8，12，16 μl进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积(μV·s)为纵坐标，进行线性拟合，得乌索酸线性回归方程为：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齐墩果酸线性回归方程为：Y=7.54×105X-3.70×104(r=0.999)。表明当乌索酸进样量在0.359～5.744 μg，齐墩果酸进样量在0.174～2.784 μg时，线性关系良好。
       2.6  精密度实验 精密吸取乌索酸和齐墩果酸的对照品混合液进样分析，平行5次，测得乌索酸峰面积相对标准偏差RSD为0.47%（n=5），齐墩果酸峰面积RSD为0.66 %（n=5）。表明进样方法和仪器系统精密度良好。
       2.7  重现性实验精密称取同一批石榴皮样品5份，制备样品溶液，进样分析。测得乌索酸峰面积RSD为1.49 %（n=5），齐墩果酸峰面积RSD为2.05 %(n=5)，表明重现性良好。
       2.8  加样回收率实验 精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的石榴皮样品6份，分高、中、低3种浓度分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品适量，样品同时处理，制备石榴皮样品溶液，进样分析，测定样品中乌索酸和齐墩果酸的含量，计算加样回收率。乌索酸和齐墩果酸的平均加样回收率分别为99.3%（RSD=2.20%）和98.5%（RSD=1.78%）。
       2.9   样品含量的测定取不同石榴皮样品溶液在上述色谱条件下进样分析，平行3次，测定峰面积，按外标法计算乌索酸和齐墩果酸平均含量。不同石榴皮样品中乌索酸和齐墩果酸存在较大差异，但两者相对含量较为稳定，乌索酸含量约为齐墩果酸的2.5倍。结果见表1。表1  石榴皮中乌索酸和齐墩果酸的含量（略）
       3  讨论
       采用二极管阵列检测器扫描分离组分的紫外吸收光谱快速、简便，可快速确定被检测组分在色谱流动相中的最大吸收波长，提取不同波长的色谱进行比对，能在有效消除背景干扰时保证检测的灵敏度［4］。
       HPLC法定量分析，一般采用紫外检测器，以保留时间定性，峰面积定量。但由于色谱方法的定量能力强而定性能力弱，对于成分复杂的中药样品来说，往往有不同的组分在同一时间或极相近的时间出峰，甚至两组分完全叠加，因而只用保留时间定性可能会造成分析结果产生意外误差。二极管阵列检测器可以同时在设定波长区域内的各波长下进行立体数据采集，既可以察看各波长下的色谱图又可以察看各时间下的光谱图，在比对保留时间的基础之上，加以光谱确认，因而可以克服仅以保留时间一项指标定性的缺点，增强了定性的确定性。此外，二极管阵列检测器与Empower色谱工作站系统适应性软件联用，可分析组分色谱峰峰纯度，进一步增强色谱方法的定性能力［5］。
       乌索酸和齐墩果酸为同分异构体，属五环三萜类化合物，结构和极性相似，紫外分光光度法和薄层色谱法均难以使2组分有效地分离，测定的结果为乌索酸和齐墩果酸的总含量。采用本文建立的HPLC法测定时乌索酸和齐墩果酸达基线分离，分离度大于1.95。经光谱归一化和峰纯度积分分析，乌索酸和齐墩果酸色谱峰均为单一组分峰［5］。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005：63.
       
       ［2］李海霞,王 钊,刘延泽.石榴科植物化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药,2002,33(8):765.
       
       ［3］安 明,赵国君,冯伟华,等.正交试验法优选石榴的提取工艺［J］.中国现代应用药学,2000,17(3):197.
       
       ［4］邹盛勤,张西安.陆英提取物乌索酸的紫外和红外光谱研究［J］.河南师范大学学报(自然科学版),2005, 33(1)：73.
       
       ［5］邹盛勤,陈 武.高效液相色谱-光电二极管检测器法测定栀子中乌索酸的研究［J］.氨基酸和生物资源,2006,28(4):77.