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       【摘要】 
       目的分析不同居群的穿龙薯蓣及其近缘品种山药、盾叶薯蓣的亲缘关系，鉴别中药材穿龙薯蓣及其近缘品种。方法采用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术扩增植物基因组DNA样品，利用NTSYS软件，建立了UPGMA聚类图 结果从50条随机引物中筛选出清晰且多态性高的引物7条。共扩增出62条DNA片段。其中54条具有遗传多样性，多态率为92.71%。遗传相似系数在0.659 5～0.875；应用引物S75，S313可有效鉴别穿龙薯蓣、盾叶薯蓣、山药。结论不同居群的穿龙薯蓣具有丰富的遗传多样性，DNA带型差异可准确区分穿龙薯蓣、盾叶薯蓣及山药，RAPD方法可以准确、快速简便地鉴定中药。尤其在正确引种方面具有很高的价值。
       【关键词】  穿龙薯蓣 引物扩增多态性DNA 遗传多样性
       The Application of RAPD Technology in Genetic Diversity Detection of Dioscorea nipponica Makino
       LIU Juan, ZHANG Chunhui, JIANG Bo
       1.Jiamusi University ,Jiamusi,154007，China; 2. The Central Hospital of Jiamusi, 154002, China
       Abstract:ObjectiveTo analyze different samples from different habitats and to identify Chinese traditional medicine Dioscorea nipponica Makino and its counterfeits. MethodsTotal genomic DNA sample of different plant pieces were amplified by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). The data of amplified bands were analyzed by the software NTSYS .The cluster map including all samples were obtained by UPGMA. ResultsSeven random primers of high stable quality were screened from 50 primers. The cluster analysis results of 62 amplified DNA fragments were indicated.54 were polymorphic and thepolymorphism rate was 92.17% ,genetic similarity coefficient was from 0.659 5 to 0.875. Application of S75，S313 could effectively identify Dioscorea nipponica Makino, Dioscorea opopsita Thunb. and Dioscorea zingiberensis C.H.Wright.ConclusionThe genetic diversity exists in population of Dioscorea nipponica Makino. RAPD is able to identify Dioscorea nipponica Makino, Dioscorea opopsita Thunb. and Dioscorea zingiberensis C.H.Wright quickly and truly, which is also quite valuable for correctly introducing plant.
       Key words:Dioscorea nipponica Makino;   RAPD;   Genetic diversity
       穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino.为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物,别名穿山龙、穿地龙、穿龙骨。主产于黑龙江、内蒙古、四川、安徽、江苏等省。其主要有效成分为薯蓣总皂苷,既是生产治疗心血管疾病药物的主要药源，又是用于合成多种甾体激素类和避孕类药物的重要药源之一。临床研究证明，穿龙薯蓣总皂苷对降血脂、平喘、抗炎和抗肿瘤有一定疗效［1］。
       随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术是Williams［2］和Welsh［3］等于1990年在PCR基础上发展起来的一种新型遗传标记技术。其技术简便易行,可用于不同物种基因组的分析。在研究生物多样性、物种进化关系、遗传图谱作图、目的基因定位等方面发挥了巨大的作用。RAPD分子标记技术由于其检测涉及整个基因组,位点多,不受材料和环境条件的影响而被广泛应用于作物遗传育种的各个方面。
       本实验采用RAPD标记技术对采自不同地区的7组穿龙薯蓣及近缘品种山药、盾叶薯蓣等植物的基因DNA进行研究，分析了它们的亲缘关系，为穿龙薯蓣研究提供DNA分子水平参考，为近一步开展穿龙薯蓣生物学研究奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       穿龙薯蓣取自6个野生居群和1个栽培居群。200506中旬取材，每居群取10个单株。取其幼嫩叶片经硅胶干燥。结果见表1。表1  样本来源（略）
       1.2  仪器
       上海热电PCR扩增仪；TGL16G台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；DU-800核酸蛋白质分析仪，美国BECKMAN公司；YLN-2000凝胶成像分析系统，北京亚力恩机电技术研究所；DYY-8B 电泳仪，北京六一仪器厂；JY-SP5电泳槽，北京君易东方电泳设备有限公司。
       2  方 法
       2.1  植物基因组DNA的提取及检测 
       取上述9组植物的经硅胶干燥的幼嫩叶3～4片，用无菌水冲洗干净，剪取30mg，在液氮中研成粉末，利用上海生工植物基因组提取试剂盒，提取植物总DNA。并按总DNA含量（μg/ml）=OD260×50×稀释倍数,计算个样本基因组DNA的浓度。
       2.2  引物及引物筛选本实验所用引物购自上海生工，共50条，分别标记为S21～S40，S71～S90，S118，S313，S120等。以供试材料中DNA质量较好的样本为模板，对引物进行初步筛选，确定有效引物。
       2.3   PCR反应条件及程序PCR反应总体积为25μl。组成如下：1 U Taq酶，Buffer缓冲溶液2.5 μl,Mg2+2.0 mmol·L-1,40 ng左右模板DNA，0.2 mmol·L-1dNTPs,0.8 μmol·L-1随机引物。
        PCR反应条件：94℃预变性30 s后,然后94℃变性30 s, 32℃退火90s，7个循环；再94℃变性30 s，41℃退火45 s，72℃延伸90s，39个循环，最后72℃保温600 s。
       2.4   PCR扩增产物电泳检测扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测。8V/cm稳压电源，1×TAB缓冲液，稳压电泳1～1.5 h。电泳结果应用紫外凝胶成像系统观察，统计PCR扩增产物的电泳带，并照相保存图像。其中特征性条带的存在或缺失，作为分子鉴别的依据。
       2.5  扩增片段遗传距离指数及数据分析对扩增产物进行统计，将电泳结果按条带的有或无量化成1和0。有带赋值为1，无带赋值为0。根据Nei等的公式: F= 2NXY/(NX+ NY)获得各样品间的遗传相似度。其中NXY为2个样品共同享有的RAPD标记数,NX,NY分别为X和Y样品各自拥有的RAPD标记数。再经D= 1- F公式计算相应的遗传距离。
       2.6  将实验数据数据输入计算机，用NTSYS软件进行聚类分析构建穿龙薯蓣及其近缘品种聚类关系图。
       3  结 果
       3.1  利用植物基因组提取试剂盒提取出质量较好的DNA。DNA的定量分析结果见表2。表2  供试材料基因组DNA定量检测结果（略）
       3.2  从50个10 bp随机引物中筛选出13个有扩增条带产生的引物，再从中选出7个扩增条带多，重复性好且条带清晰的有效引物。结果见表3。表3  引物扩增结果（略）
       3.3  利用7条有效引物，对穿龙薯蓣6个野生居群、1个栽培居群及其近缘品种山药、盾叶薯蓣进行RAPD扩增，并对扩增结果进行统计见表4。（引物S75对各居群的扩增条带的统计结果）表4  S75扩增DNA谱带（略）
        电泳结果见图1。（ S75的RAPD扩增结果)表明 7个引物共扩增出62条带。其中54条带表现出多态性，多态性带占总扩增条带的92.71%。平均每引物扩增出8.86条多态性DNA带。说明不同居群组间具有较高的遗传变异。扩增条带数最多的是S75为13条;扩增条带最少的为S85,为5条。可见引物不同扩增产物则有明显的差异。
       3.4  遗传距离的计算结果根据Nei等的公式计算出7组穿龙薯蓣及近缘品种山药、盾叶薯蓣间的遗传距离。9个样品之间的遗传距离结果见表5。其中c与h的遗传距离最大为0.524；e与g的遗传距离最小为0.125；说明各居群穿龙薯蓣在分子水平上是属于同一个种。表5  样本遗传距离（略）
       3.5  RAPD标记聚类分析结果用NTSYS软件对7组穿龙薯蓣及近缘品种山药、盾叶薯蓣的亲缘关系进行了聚类分析。结果见图2。
       4  讨论
       近年来，随着科技水平的不断提高，皂素的用途日益广泛，国内外合成甾体激素类药物迅速发展，对薯蓣皂苷元的需求剧增，造成穿龙薯蓣野生资源已经远远不能满足需求。科研工作者对其野生变家种进行了大量的研究。但有文献报道人工栽培的穿龙薯蓣面临品质退化、产量降低的危险。而应用RAPD从DNA分子水平上对穿龙薯蓣的居群进行准确鉴别，揭示穿龙薯蓣的遗传多样性，对该资源开发和保护以及遗传育种有重要意义。采用RAPD分子标记可以从DNA水平上，选择理想优质的居群进行集约化培育。另外，有关RAPD用于穿龙薯蓣的居群鉴别尚未见报道。
       穿龙薯蓣的居群中，辽宁与宁安在地理关系上最近，遗传距离也最小为0.125，研究表明品种间亲缘关系的远近与地理分布有一定的相关性。
       本文从DNA水平上分析不同来源的穿龙薯蓣7个居群的遗传多样性，包括种群间和多年生与一年生、野生与栽培种群遗传多样性的比较，并将穿龙薯蓣与其近缘品种盾叶薯蓣、山药进行对比。研究表明，穿龙薯蓣、盾叶薯蓣、山药的不同品种能在RAPD带中得到有效标识，其中穿龙薯蓣特异带较多，遗传分化较大。可以为穿龙薯蓣品种鉴定、筛选、种质培育和野生资源保护提供可靠的依据。
       本文中所用试剂盒提取出的植物DNA，虽然有较好的纯度，但含量相对较低。建议再做有关实验是否改用大剂量植物DNA提取试剂盒。
       【参考文献】
         　　［1］方一苇，赵家俊，贺玉珍.穿龙薯蓣中两种水难溶性甾体皂苷的结构研究［J］.药学学报，1982，17（5）：387.
       
       ［2］Williams J G K, Kubelik A R K,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers and useful gene markers［J］.Nucleic Acids Res, 1990,18(10):6531.
       
       ［3］Welsh J,McClell and MFinger printing gencmes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucl Acids Res, 1990,18：7213.