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       【摘要】 
       目的研究肿节风浸膏对羟自由基（HO·）和超氧阴离子自由基（O2·－）的作用。方法采用邻二氮菲-Fe2＋氧化法检测不同浓度肿节风浸膏水溶液对H202/Fe2＋体系产生的HO·的清除作用；邻苯三酚自氧化法测定肿节风浸膏溶液对O2·－的作用。结果肿节风浸膏溶液浓度分别为0.2，0.4，0.6，1.2 mg·ml-1时的HO·清除率分别为0.89%，17.52%，49.35%，89.89%，组间有量效关系；肿节风浸膏溶液浓度为0.01 mg·ml-1时对O2·－抑制率为-76.84%。结论肿节风浸膏溶液在体外有显著清除HO·的作用，促进O2·－生成。
       【关键词】  肿节风 浸膏 羟自由基 超氧阴离子自由基
       The Effect of Sarcandra glabra Extracts on Oxygen Free Radical
       QIN Jian，WANG Rensheng，TENG Jiaan，CHEN Jian，HUANG Renbin
       1.Department of Radiation Oncology, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530007, China；
       2.Department of Pharmacology, Guangxi Medical University,  Nanning 530021,China
       Abstract:ObjectiveTo study the effect of Sarcandra glabra extracts on superoxide anion free radical (O2·－) and hydroxy free radical (HO·)．MethodsSpectrophotometry (wavelength 322 nm and 510 nm) was used to observe the effects of Sarcandra glabra extracts on superoxide anion free radical and hydroxy free radical. To study scavenging effect of hydroxy free radical in different presence of Sarcandra glabra extracts, we applied 1,10-Phenanthroline-Fe2+ oxidative to assay it produced by H2O2/Fe2+，and applied autoxidation of pyrogallol to assay superoxide anion free radical, in order to know the effect of Sarcandra glabra extracts on it. Results In the presence of Sarcandra glabra extracts at the concentration of 0.01 mg·ml-1 in vitro, the generation of O2·－was inhibited by -76.84%, and in the presence of Sarcandra glabra extracts at the concentration of 0.2，0.4，0.6，1.2 mg·ml-1 in vitro, the level of  HO· was reduced by 0.89%，17.52%，49.35%，89.89%, respectively. It has dose-effect relationship between groups. ConclusionSarcandra glabra extracts can greatly scavenge HO·, and enhance the production of O2·－.
       Key words:Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai；  Extracts；  Superoxide anion free radical；  Hydroxy free radical
       肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全株。肿节风含有黄酮苷、氰苷、香豆素、内酯、挥发油等。味微苦、辛、平，归心、肝经。具有清热凉血、活血消斑、祛风通络的功能［1］。主用于炎症性疾病的治疗。拟从氧自由基（oxygen free radical，OFR）的角度来了解其机制，本实验研究了肿节风浸膏对羟自由基（HO·）和超氧阴离子自由基（O2·－）的作用。
       1  器材
       1.1   药品肿节风干浸膏（0.091 g浸膏/g生药），广西南宁东兰制药厂提供。
       1.2   试剂H2O2，重庆川江化学试剂厂；邻苯三酚，中国医药上海化学试剂公司，分析纯；邻二氮菲，上海试剂三厂，分析纯；FeSO4，上海试剂三厂，分析纯；pH 7.34的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和氢氧化钠配制；pH 8.34的磷酸缓冲液(PBS)用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制。
       1.3   仪器Beckman DU640紫外分光光度计，722型分光光度计，pH数字显示酸度计.
       2  方法
       2.1   样品制备取肿节风干浸膏（0.091 g浸膏/g生药）2 g，用单蒸水40 ml稀释成浓度为50 mg/ml的肿节风浸膏溶液。
       2.2   羟自由基（HO·）的生成及清除率的测定按参考文献的方法［2，3］，采用H2O2/Fe2＋体系，通过Fenton反应生成HO·，促使邻二氮菲-Fe2＋被氧化为邻二氮菲-Fe3＋，造成其水溶液在波长510 nm处最大吸收消失，来测算其清除率。实验方法如下：邻二氮菲0.35 mmol·L-1，FeSO4 0.4 mmol·L-1，pH 7.34的PBS 150 mmol·L-1，加0.015%H2O2（损）或不加H2O2（未损），37℃保温90 min，于波长510 nm处测吸光度值，得A损与A未损。邻二氮菲0.35 mmol·L-1，FeSO4 0.4 mmol·L-1，PBS（pH 7.34）150 mmol·L-1，0.015% H2O2，加入一定量肿节风浸膏溶液，各加药管以PBS（pH 7.34）加等量药液得同浓度的肿节风浸膏溶液作参比，将上述试管同时置于恒温水槽中，37℃保温90 min，测得A样。每处理重复10次，取其平均值按下式计算HO·清除率。
       HO·清除率S%=（A样- A损）/（A未损- A损）×100%
       2.3   O2·－生成的抑制率测定利用O2·－清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在322 nm处的吸收峰受到抑制的特点，进行光化学方法测定，间接测得O2·－生成及抑制率。按参考文献的方法［4］，采用如下实验方法：总体积4.5 ml的PBS（pH 8.34）50 mmol·L-1，邻苯三酚0.2 mmol·L-1， 反应温度为25℃，加入一定量肿节风浸膏溶液，加药管以PBS（pH8.34）加等量药液得同浓度的肿节风浸膏溶液作参比。用动态方法测定O2·－生成的反应初速率V0(A·min-1)。反应启动后每30s测一相应A322nm值，至4.5 min止。将所得A322 nm 值与时间t(min)进行回归分析，其斜率为V样。另取试剂同上，不加肿节风浸膏溶液以作对照，用pH 8.34的PBS作为参比，余步骤同上，测得斜率V空。每处理重复10次，取其平均值按下式计算O2·－生成的抑制率：
       O2·－抑制率Ⅰ%=(V空-V样)/V空×100%
       2.4   数据处理所有数据均以±s表示，采用t检验、线性相关和回归分析进行统计处理。
         结果
       3.1  对HO·的作用在本实验条件下，由A510 nm的测定值观察肿节风浸膏溶液对HO·的清除作用。结果显示肿节风浸膏溶液对其具有显著的清除作用（结果见表1及图1），并随浓度的增加清除作用增强，相关系数r=0.985 5。表1  肿节风浸膏溶液对HO·的作用
       组别浓度C/mg·ml-1A510nmHO·清除率S（略）
       3.2  对O2·－生成的作用用动态方法测得反应的初速率V0（A·min-1）。本实验直线回归方程分别拟合如下：对照组y = 0.131 7x - 0.015，肿节风组y = 0.233x + 0.041。其回归相关系数对照组在0.999 3～0.999 9之间，肿节风组在0.989 1～0.999 7之间。加入肿节风浸膏溶液后，其斜率明显大于对照组，即O2·－生成速率V0显著上升（结果见表2及图2），差别有统计学意义（P＜0.05）。表明肿节风浸膏溶液能促进O2·－的生成。表2  肿节风浸膏溶液对O2·－生成的作用（略）
       4  讨论
       OFR是生物体在物理和化学的作用下产生或衍生出来，包括HO·，O2·－，单线态氧(1O2)等。在正常情况下，由于体内存在自由基清除剂，体内OFR的产生与清除保持相对平衡，并参与许多正常的生理生化反应。若自由基清除剂的合成恶性化或自由基反应发生紊乱，则可引起机体一系列病理生理改变［5］，导致某些疾病的发生与发展。一方面OFR能够调节花生四烯酸的代谢，刺激吞噬细胞和中性粒细胞的吞噬杀菌功能和免疫过程，有利于机体健康；另一方面，OFR可使许多生物大分子如核酸、蛋白、膜多不饱和脂肪酸发生超氧化反应，使生物大分子出现交联或断裂，引起细胞结构和功能的破坏［6，7］。目前已证实机体多个系统的多种疾病的发生、发展都与氧自由基有关［8］。放射治疗时，辐射的生物效应在很大程度上是间接通过辐射对水的作用形成HO·，O2·－等OFR，通过物理－化学－生物这样一个复杂的连锁反应而最终导致放射损伤［9］。
       肿节风是一种活血化淤、清热凉血、祛风通络的中药，也有一定的抗肿瘤作用。其成分复杂，含有挥发油、黄酮、香豆精、有机酸等。临床上常被用于炎症性疾病的治疗。有学者 ［10～12］应用肿节风注射液治疗急性乳腺炎、小儿支气管肺炎、老年慢性支气管炎急性发作期，均有较好疗效，且未见明显毒副作用。表明肿节风注射液有明显的抗炎作用。Fenton反应是生物体内产生HO·的重要机制，本研究即模拟机体在体外采用H2O2/Fe2＋体系通过Fenton反应产生HO·来检测肿节风浸膏溶液清除HO·的能力。结果是肿节风浸膏溶液在体外有明显清除HO·的作用，并随剂量的增加清除作用增强。这样就提示肿节风浸膏溶液在体内对HO·可能也会有显著的清除作用。剂量组分别为0.2，0.4，0.6，1.2 mg·ml-1时的HO·清除率分别为0.89%，17.52%，49.35%，89.89%，并存在明显的量效关系。0.2 mg·ml-1剂量组与对照（损）比较无显著性差异（P<0.05），可能是因为药物剂量低于0.2 mg·ml-1不能有效清除HO·。肿节风浸膏溶液对HO·高效的清除作用是否为其抗炎的主要机制之一，目前还有待进一步证实。刘兆乾等［13］研究表明：肿节风总黄酮苷对小鼠移植性肿瘤S180腹水型肉瘤细胞在体外有明显的抑制作用。早期遵义医学院肿瘤研究组［14］对肿节风抗癌作用做了初步研究，提示肿节风干浸膏、注射液、挥发油等均有不同程度的抗癌效应，肿节风挥发油对ECA，L615，L7712等瘤细胞均有很强的直接杀伤作用，而肿节风干浸膏的直接杀伤作用不明显。可见肿节风的抗癌作用不仅仅是通过细胞毒作用实现的。本实验通过研究肿节风浸膏溶液对O2·－的作用，结果显示低浓度（0.01 mg·ml-1）的肿节风浸膏溶液即对其有显著的促进作用，其抑制率为76.84%。能否从自由基的角度来解释其抗癌机制，值得进一步探讨和研究。
       【参考文献】
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