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       【摘要】 
       目的探讨左归丸对AD鼠氧化反应及细胞凋亡的影响。方法模型组以β淀粉样蛋白（Aβ）注射海马制备AD动物模型，各治疗组分别在造模的同时灌胃左归丸和抗脑衰胶囊、脑复康。采用生化法检测各组大鼠脑匀浆CAT，MAO，免疫组化方法观察各组大鼠海马神经元TNF-α蛋白的变化，运用RT-PCR测定各组海马caspase3基因的表达。结果灌服后左归丸治疗组均能明显提高AD大鼠脑组织CAT活性、抑制MAO活性；中药治疗组能显著下降海马区域TNF-α含量和下调caspase-3 mRNA的表达。结论左归丸对痴呆鼠海马神经元细胞凋亡有抑制作用，其作用机理可能是通过提高CAT等抗氧化酶作用和抑制MAO活性，下降海马区域TNF-α蛋白含量和下调caspase-3 mRNA的表达。
       【关键词】  左归丸 老年性痴呆 β淀粉样蛋白 氧化反应 细胞凋亡
       Effects of Zuoguiwan on Antioxidation and Ultrastructure of Alzheimer"s Disease Model Rats
       TIAN Xusheng, AN Ping
       (Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Zuoguiwan on antioxidation and Apoptosis of Alzheimer"s disease(AD) model rats. MethodsThe hippocampus injected β-amyloid(Aβ) to make AD models. Every group was fed with Naofukang, Kangnaoshuai and Zuoguiwan. The contents of CAT and MAO in the brain were measured by the method of biochemistry and molecular biology. The expression TNF-α protein of hippocampus neurons was observed by electron lens using immunohistochemistry method. The expression of caspase-3 gene was measured by the methods of RT-PCR and agarose gel electrophoresis.ResultsZuoguiwan could reduce the activity of MAO and improve the activity of CAT in the brain. Zuoguiwan could reduce the expression of caspase-3 gene and TNF-α protein of Hippocampal neurons. ConclusionZuoguiwan has repressive effects on apoptosis of Hippocampal neurons in AD model rats. The effective mechanism may associate that Zuoguiwan reduces the activity of MAO and improves the activity of CAT in the brain, reduces the expression of caspase-3 gene and TNF-α protein of Hippocampal neurons.
       Key words:Decoction of Rehmanniae;  Alzheimer"s disease;  β-amyloid protein;  Stress response of oxidation;  Apoptosis
       老年性痴呆（AD）是一种常见于老年人的神经退行性变性疾病。本实验根据AD发病的β淀粉样蛋白（Aβ）致病学说［1］制备AD动物模型，观察左归丸对AD抗氧化作用及超微结构的影响，旨在探讨本方防治AD的作用机理。
       1  器材
       1.1  动物健康Wistar大鼠140只，重(260±20)g，雌雄各半，黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
       1.2  药物与试剂左归丸(熟地、山药、枸杞等购于哈尔滨人民同泰药店)常规水煎浓缩至1 g(含生药)/ml。抗脑衰胶囊由石家庄四药股份有限公司生产。脑复康天津金世制药有限公司提供。试剂：Aβ1-40，Sigma公司提供。CAT，MAO检测试剂盒由南京建成生物化学有限公司提供。TNF-α免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。pv二步法免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。TRIzol Reagent 、Thermoscript TM  RT-PCR试剂盒均由Invitrogen 公司生产。引物由上海生物工程有限公司合成。
       1.3  仪器脑立体定位仪（NARISHIGE SN-2型日本）、摄影显微镜（OLYMPUS日本）、PCR扩增仪（PE2700）、紫外凝胶成像仪（Labworks 4.5 UVP）等。
       2  方法
       2.1  分组方法140只Wistar大鼠随机分成7组：空白组，假损伤组，模型组，抗脑衰对照组，脑复康对照组，中药治疗高、低剂量组，每组20只。
       2.2  模型制备凝聚态Aβ直接定向注射右侧海马CA1区。制备模型：麻醉，固定在脑立体定位仪上，暴露前囟，参照包新民等［2］编《大鼠脑立体定位图谱》在前囟后3.0 mm，中线右侧旁开2.2 mm，用手摇钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2.8 mm，然后向脑组织内缓慢注射Aβ 1 μl,注射5  min,留针5 min。空白组不处置，假损伤组注射生理盐水1 μl，余组均注射Aβ。
       2.3  给药方法及取材中药治疗组腹腔注射造模同时分别给予左归丸高、低剂量灌胃〔相当含生药5 g/(kg·d）和2.5 g/(kg·d）〕,中、西对照组分别给予抗脑衰胶囊、脑复康灌胃〔（含生药分别为2.4 g/(kg·d）,0.02 mg/(kg·d）〕，余组灌胃等量蒸馏水，1次/d，共4周。脑内注射Aβ 1周后，每组取9只迅速处死，在冰上断头取脑，在针孔处切取脑组织置于多聚甲醛液中固定供光镜观察使用。余下在冰上迅速处死，左侧取大脑（除小脑）作生化指标；右侧取脑迅速分离海马置于液氮中冷冻以备提取RNA使用。
       2.4  观察指标
       2.4.1  MAO，CAT测定大鼠断头取脑，制备脑匀浆，离心，取上清液。测定参照试剂盒说明书。
       2.4.2  脑TNF-α蛋白表达检测脑组织固定，梯度脱水，透明，包埋，切片，采用免疫组化观察鼠脑海马神经元TNF-α蛋白表达。
       2.4.3  大鼠海马caspase-3基因的表达按Trizol试剂盒说明书提取RNA。逆转录体系参照Thermoscript TM cDNA合成试剂盒说明书。聚合酶链式反应（PCR）：引物设计由美国NCBI数据库提供RNA全序列、 primer3软件设计。Rat caspase-3序列略。PCR反应参数：95℃ 4 min；94℃ 40 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s，30个循环；72℃ 5 min。PCR产物用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳分离检测。
       2.5  数据处理数据采用
       ±s表示，数据统计分析均在SPSS11.0软件中进行，采用方差分析，多组间两两比较用LSD法。
       3  结果
       3.1  左归丸对AD鼠脑匀浆MAO，CAT的影响结果见表1。结果表明造模后可引起脑组织中的MAO含量显著增多、CAT含量明显降低，与空白组、假损伤对照组比较有显著差异（P<0.01）。服药后各组均能明显提高AD大鼠的脑组织CAT活性、抑制MAO活性，与模型组比较均有差异，其中左归丸高剂量组效果最为明显（P<0.01），说明左归丸与中、西对照组相比具有明显改善痴呆大鼠过氧化损伤的作用。表1  左归丸对AD大鼠脑匀浆MAO，CAT的影响（略）
       3.2  左归丸对AD大鼠脑TNF-α蛋白的影响实验结果采用CMIAS多功能真彩色病理图象分析系统进行分析，输入计算机，计算阳性目标总面积与统计场总面积比值，取平均值进行统计分析。结果见表2。表2  各组大鼠海马神经元TNF-α蛋白表达的影响（略）
        结果显示模型组TNF-α均呈强阳性表达与空白组和假损伤组相比，差异显著（P<0.01）。表明AD动物模型诱导脑组织TNF-α蛋白表达增强。经治疗后各组TNF-α蛋白含量均显著下降，其西药对照组及高剂量组效果最为显著（P<0.01），说明左归丸效果最佳，且具有剂量差别。
       3.3  大鼠海马caspase-3 mRNA的表达RT-PCR结果示，Aβ可诱发大鼠海马caspase-3 mRNA表达增加，与模型组比较，治疗组、对照药均可不同程度降低大鼠海马区域的表达(P<0.05)，中高组下调幅度最大（见图1～2）。
       4  讨论
       老年性痴呆是以肾精不足，髓海失养而成痴呆的本虚为特征。左归丸是经典补肾填精方药，符合老年性痴呆的病机特点，在治疗上遵循“虚者补之”的原则，其意义在于使肾气充盛、精髓得化、髓海得充以醒神，因此历代中医用此方加减调治AD多有良效。
       近年来越来越多的凋亡调节因子被证实参与AD神经元凋亡的调控［3］。半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）属ICE样蛋白酶家族，是近年发现的一组介导细胞凋亡的关键性蛋白酶，其中最重要的caspase3被认为是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路——所有细胞凋亡的最后执行者。本实验中左归丸对海马区域caspase3基因mRNA水平有明显降低作用(P<0.05)。我们推测左归丸可能通过消除自由基的产生，提高CAT等抗氧化酶作用和抑制MAO活性，最终抑制caspase3引起级联反应，防止细胞内具有功能的蛋白质水解、切割，从而达到抑制神经元细胞凋亡的目的。本实验通过免疫组化方法发现左归丸能够抑制海马周围神经元的TNF-α蛋白，我们知道TNF-α不仅是激活细胞因子级联反应的主要物质，而且还是典型的促凋亡因子之一［4］。因此推测左归丸还可能通过抑制细胞因子TNF-α活性，防止海马神经元细胞凋亡。综上所述左归丸对痴呆鼠海马神经元细胞凋亡有抑制作用，其作用机理可能是通过消除自由基的产生，提高CAT等抗氧化酶作用和抑制MAO活性，下降海马区域TNF-α蛋白含量和下调caspase-3 mRNA的表达。
       【参考文献】
         　　［1］Selkod D J. Alzheimer"s disease: a central role for amyloid［J］.J Neuropathol Exp Neurol,1994,53:438.
       
       ［2］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：40.
       
       ［3］桂兰润，李文彬.Caspase酶与神经系统变性疾病［J］.中华神经科杂志，2002，35（1）：43.
       
       ［4］王巧稚.β淀粉样蛋白与阿尔茨海默病神经细胞凋亡的关系［J］.四川解剖学杂志,2003，11（2）：33.