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       【关键词】  黄连
       摘要: 小檗碱是具有双氧桥环状结构的一种重要次生代谢产物，研究小檗碱的生物合成对于通过基因工程手段提高小檗碱的产量具有重要的指导意义。综述了近年来黄连小檗碱生物合成途径催化各步反应的酶（尤其是关键反应）及编码这些酶的基因的研究进展。
    
　　关键词: 黄连; 小檗碱; 生物合成; 酶
   
　　Progress in the Study of Berberine Biosynthetic Enzymes of Coptis  ZHOU J ia-yu， LIAO H ai
   
　　（College of Pharmacy，Southwest Jiaotong Unversity，Emei614202，China）
   
　　Abstract: Berberine is a kind of important secondary metabolites with methylenediory bridge structure.To improve production yield of berberine of Coptis cells by genetic engineering means，it is important to understand the berberine biosynthesis pathway.Recent progresses of the studies on the enzymes and the genes involved in berberine biosynthesis，especially those enzymes that catalzye the committed steps and their corresponding genes are reviewed in this paper. Key words: Coptis; Berberine; Biosynthesis; Enzymes
       黄连是一种著名的中药，《神农本草经》列之为上品，具有抑菌、消炎、健胃、降压和抗肿瘤等作用。黄连的根茎味极苦，苦味在于它含小檗碱（berberine）和黄连碱（coptisine）等原小檗碱型苄基异喹啉生物碱。由于小檗碱在植物体中的含量相当低，加之黄连属植物入药部位（根茎）生长缓慢，这对小檗碱的进一步开发利用造成了很大的困难。20世纪70年代以来，科技人员围绕日本黄连（Coptis japonics L.）进行了大量的诱导愈伤组织和细胞培养工作，已筛选出稳定高产的细胞系，用于工业化生产小檗碱及其衍生物［1］ 。目前我国也已建立了黄连（Coptis chinensis Franch.）的细胞培养体系，以求能够小量生产小檗碱。近年来，不断有与黄连小檗碱合成有关的代谢中间体、酶及其基因被发现，使得人们对其合成路线有了较清楚地认识。本文主要综述了黄连小檗碱生物合成途径中的相关酶及其基因的研究进展，这对黄连小檗碱等次生代谢产物的生产调控具有重要的指导意义。
       　1 小檗碱生物合成途径
       小檗碱的合成大致可分为两个阶段  ［2］ :第一阶段发生在细胞质中，小檗碱的两种合成原料（多巴胺和4-羟苯乙醛）在去甲乌药碱合成酶的作用下，缩合形成苄基异喹啉生物碱生物合成的第一个中间体去甲乌药碱（norcoclaurine）。去甲乌药碱经历几次甲基化作用，接受来自腺苷甲硫氨酸的甲基，转化为另一个重要中间体番荔枝碱（reticuline）。第二阶段是在内质网的囊泡内进行，有研究表明小檗碱合成途径中后面的大多数酶均位于内质网囊泡中。番荔枝碱经特殊的载体转运进入内质网的囊泡，在此发生成环作用而形成小檗碱桥，后者进一步形成原小檗碱的基本骨架-金黄紫堇碱（scoulerine）。金黄紫堇碱从腺苷甲硫氨酸处获取甲基形成四氢非洲防己碱（tetrahydrocolumbamine）。有研究表明，四氢非洲防己碱在氢化小檗碱合成酶的催化下，形成特殊的亚甲基双氧环结构，转化为氢化小檗碱
（canadine）。小檗碱合成的最后步骤由四氢小檗碱氧化酶催化，利用氢化小檗碱为底物氧化脱氢，最终形成小檗碱。现将小檗碱合成的主要途径概述于图1。
      
　　1.（s）-去甲乌药碱合成酶;2.（s）-腺苷甲硫氨酸:去甲乌药碱6-O甲基转移酶;3.（s）-腺苷甲硫氨酸:乌药碱N-甲基转移酶;4.N-甲基乌药碱4`-羟化酶;5.（s）-腺苷甲硫氨酸:3`羟基-N-甲基乌药碱4`-O-甲基转移酶;6.小檗碱桥酶;7.（s）-腺苷甲硫氨酸:金黄紫堇碱9-O甲基转移酶;8.氢化小檗碱合成酶;9.四氢小檗碱氧化酶.
  
　　以酪氨酸为底物合成小檗碱经历了13步酶促反应，目前已有多种相关酶及其基因序列被克隆并进行了较为详细的性质研究，使人们有可能从基因水平去控制小檗碱的合成。
       2.1 甲基转移酶
    
　　在小檗碱合成中，甲基转移酶控制代谢物反应的方向，促使中间物质的定向流动［3］ 。甲基转移酶有着极高的底物专一性，能够清楚地识别其底物，并有选择性地发生反应。
    
　　2.1.1 氮甲基转移酶（NMTs）
       乌药碱N-甲基转移酶（CNMT）催化将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到乌药碱的氨基上，生成N-甲基乌药碱的反应［4］ 。N-甲基乌药碱作为一种诱导因子，激活氧甲基转移酶的活性，使底物的代谢转化能够连续［4］ 。Choi［5］ 等从培养的黄连细胞中分离纯化得到了CNMT。该酶由四个相同亚基组成，分子量为160kDa，其活性受到一些重金属离子例如Co2+ 、Cu2+ 和Mn2+ 的抑制，但对Hg2+ 却有较高的耐受性。酶的特性分析表明，（R）-乌药碱与CNMT的亲和力最高，是其最适底物。此外，黄连的CNMT可以使去劳丹碱发生去甲基化反应，而小檗的CNMT则无此能力，表明小檗碱在不同植物中的合成途径仍然有较大的差异。Choi［3］ 等从黄连中克隆得到CNMT的基因，该基因在大肠杆菌中表达得到其重组酶，结构分析表明该酶含有一个S-腺苷甲硫氨酸的结合区，该区与番茄的磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶有较高的同源性。
       2.1.2 氧甲基转移酶（OMTs）
       氧甲基转移酶催化将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到氧原子上的反应。在生物碱和黄酮类物质的合成中，氧甲基转移酶都发挥着重要的作用。Joshi［6］ 等发现56种不同植物来源的氧甲基转移酶在序列上有较大的相似性（32-71%），其中以S-腺苷甲硫氨酸结合区和催化位点保守性最高，而底物结合位点变化较大。Takashita［7］ 等还发现氧甲基转移酶的氮末端多肽序列对维持其活性是必需的。小檗碱的合成涉及到去甲乌药碱6-O-甲基转移酶（6-OMT）［8］ ，甲基乌药碱4`-O-甲基转移酶（4`-OMT）［4］ 和金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶（SMT）［9］ 等三种甲基转移酶（表1）。三种甲基转移酶分子的羧基
端为S-腺苷甲硫氨酸结合区，氨基端是底物结合区，其中底物结合区的氨基酸序列变化较大，这也从侧面反映它们分别催化不同的底物发生反应。SMT分子的氮末端还有一段10个氨基酸的疏水序列，可能与其在内质网上定位有关。
   
　　Sato［10］ 等利用6-OMT和4`-OMT基因在罂粟中的高效表达来研究小檗碱代谢的调控网络，借此探讨小檗碱生物合成的关键步骤。结果表明二者对生物碱产量的影响有较大差异，其中4`-OMT的过量表达对生物碱的产量影响甚微，而6-OMT的过量表达却能够显著提高生物碱的产量，表明6-OMT催化的反应可能是提高小檗碱产量的重要基因控制位点。Takashita ［7］ 等将黄连的SMT基因在大肠杆菌中进行异源表达，经纯化的重组酶与天然蛋白比较在氨基酸序列特征方面很相似，只是在前者氮末端具有一段10个氨基酸长度的靶序列（用于定位和在内质网中的加工），表明SMT基因首先表达出含有靶序列的前体，靶序列再经过翻译后的加工剪切，才能形成成熟的SMT。Takashita［7］ 等发现在黄连小檗碱高产细胞系156-1中，SMT基因高效表达，基因拷贝数比野生型多3个，并且小檗碱产量的增加与相应的酶水平都得以迅速的提高，表明SMT在小檗碱及其衍生物的合成方向起着调节作用，可能是小檗碱生物合成途径的关键酶。表1 参与黄连小檗碱生物合成的OMTs的特性（略）
       2.2 细胞色素P450 酶 与动物肝组织中的细胞色素P450 酶不同，植物细胞色素P450 酶具有高度的底物专一性，催化底物发生羟基化、去甲基化反应或形成亚甲基双氧桥结构。在小檗碱的合成中，细胞色素P450 酶介导了甲基乌药碱的羟化反应和四氢非洲防己碱的双氧桥形成反应。Ikezawa［11］ 等用同源PCR方法从黄连细胞中获得了编码甲基乌药碱羟化酶（CYP80B2）的cDNA克隆，该克隆在酵母中表达得到其重组酶，酶活性分析表明该酶能催化甲基乌药碱的羟化反应，并且该酶与罂粟的甲基乌药碱羟化酶（CYP80B1）在氨基酸序列特征方面很相似，有68.4%的同源性，推测CYP80B1与CYP80B2可能起源于同一祖先基因。他们［11］ 还从黄连中成功分离到氢化小檗碱合成酶基因（CYP719），该基因由1473个核苷酸组成，编码491个氨基酸。CYP719属于一个新的P450 酶家族，具有P450 酶的一些基本特性，比如对NADPH和氧分子具有极高的亲和力，然而与氧分子结合的并非苏氨酸，而是以丝氨酸残基（296位）代替，这种现象在P450 酶中极为少见。尽管CYP719能催化亚甲基双氧桥结构的形成反应，但它只能专一性地催化四氢非洲防己碱转化为氢化小檗碱，而无法催化金黄紫堇碱形成刺罂粟碱。因此，Ikezawa［11］ 等认为亚甲基双氧桥的生物合成涉及两种酶，一种催化四氢非洲防己碱的环化反应，最终产物为小檗碱;另一种酶催化碎叶小檗碱形成刺罂粟碱，最终产物为黄连碱。从结构上而言，在CYP80B2和CYP719分子中都具有一些相似的结构成分，诸如羧基端的螺旋区、芳香族区、血红素结合区以及氨基端的疏水结构区，该疏水区与它们在内质网膜上的定位有关。
    
　　2.3 黄素氧化酶
       小檗碱桥酶（BBE）和四氢小檗碱氧化酶（STOX）通过黄素辅因子发生氧化还原反应。在它们的结构中，都有一些保守氨基酸序列，比如黄素的共价结合位点，该位点含有一个重要的组氨酸残基。已证实BBE是小檗碱生物合成的一种关键酶，通过BBE的催化使番荔枝碱的N-甲基环化而形成小檗碱的完整C环，它提供了原小檗碱类生物碱合成的基本骨架-金黄紫堇碱［12］ 。王东［14］ 等认为STOX可能是另一种关键酶，因为只有经过STOX才能催化（S）-四氢小檗碱的1位碳氮键发生氧化反应，并最终形成小檗碱。与其他只能催化两个氢原子发生反应的氧化酶不同，STOX可以同时催化四个氢原子发生氧化反应。STOX能与多种（S）-型四氢异喹啉类生物碱反应，其广泛的底物专一性和较高的热稳定性使STOX在生物模拟合成中具有重要作用。Okada［13］ 等从黄连细胞cDNA文库中筛选到该酶的cDNA克隆，核苷酸序列分析表明它与细胞色素P450 酶有一定的相似性。在黄素氧化酶的合成初期，其前体的氮末端有一段较短的内质网转移肽，指引其锚定在内质网膜上，随后转移肽被切除，成为成熟的黄素氧化酶。在细胞发育初期，BBE和STOX常被贮藏在碱性的内质网囊泡内，而在后期，许多囊泡融合形成中央液泡，液泡中的pH值逐渐变为酸性，使BBE和STOX失活，于是小檗碱就积累在中央液泡中。
    
　　3 展望
    
　　随着黄连生物碱生物合成研究的进一步深入和不断延伸，对黄连培养细胞进行基因操作，使生物合成基因（特别是关键反应酶的基因）高效表达，以提高黄连小檗碱或其衍生物的产量的技术具有无污染、选择性高和易于扩大化等显著的特点。在不久的将来，小檗碱的商业化生产必将成为现实。
       　　参考文献:
    
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       基金项目: 西南交通大学峨眉校区科技发展基金（No.03011012）
       作者简介: 周嘉裕（1976-），女（汉族），四川成都人，现任西南交通大学药学院讲师，硕士学位，在读博士研究生，主要从事药用植物代谢工程研究工作.
       （西南交通大学药学院，四川峨眉 614202）
       收稿日期: 2005-03-16