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       【摘要】 
       目的 探讨长春新碱对人胃癌细胞杀伤作用和GSTπ表达的影响。方法利用人胃癌细胞株(型)进行培养，加入硫酸长春新碱注射液，5 h和10 h后进行光镜和电镜观察和SP免疫组织化学染色。结果10 h组外型畸变和细胞器破坏严重; 5 h组GSTπ表达位置和灰度发生变化以核最明显。结论长春新碱对人胃癌细胞的杀伤作用和对GSTπ基因表达的影响与作用时间有关。
       【关键词】  长春新碱 胃癌 谷胱甘肽S转移酶 免疫组织化学染色
       Effects of  Vincristine on the Expression of Glutathion Transfer Enzyme (GSTπ )in Human Gastric Cancer Cells
       ZHAO Ying，LI Haifeng，BO Aihua, XUE Guiping, ZHANG Xiaoli
       (Hebei North University , Zhangjiakou  075000, China )
       Abstract:ObjectiveTo study the killing function to person"s gastric cancer cells and the expressions of GSTπ with vincristine.MethodsAs person"s gastric cancer cells being educated, vincristine for junction were injected to educate continuously for 5 h or 10 h, then the person"s gastric cancer cells were observed under optical microscope and transmission electron microscope, and stained with immunohistochemical method.ResultsThe configuration was aberrant and the cell organs were seriously destroyed in the group for 10 hours. The changes of position and ash degree were exited in expression of GSTπ, and was the most obvious in nucleas.Conclusion The killing function to gastric cancer cells and the expression of GSTπ with vincristine has a significant relation to the acting time.
       Key words:Vincristine(VCR),   Gastric cancer,   Glutathion transfer enzyme(GSTπ ),   Immunohistochemical method
       长春新碱(Vincristine,VCR)有广泛的抗肿瘤作用。为了探讨VCR抗肿瘤作用途径，我们采用了细胞培养技术，电子显微技术及免疫组织化学染色方法，对VCR作用5 h和10 h后的人胃癌细胞超微结构和GSTπ表达状况进行研究，为深入认识VCR作用机制提供依据。
       1  材料和方法
       1.1   材料 
       长春新碱由深圳万乐药业有限公司生产，BCG-823胃癌细胞由北京肿瘤研究所提供。二氧化碳培养箱和RPMI1640培养液由河北北方学院实验中心提供。SP免疫组织化学试剂盒及兔抗人GSTπ抗血清和DAB显色剂购于北京中山生物技术公司。
       1.2  方法
       将5×104浓度的BCG-823细胞接种于无菌96孔板和6孔板中，培养24 h。在6孔板中加入无菌盖玻片，使癌细胞附壁生长（爬片）。对照组不加入药物，实验5 h组，即加入VCR 15μl, 培养5 h后收获，实验10 h组则加药后培养10 h，然后将培养液中细胞离心，2.5%戊二醛前固定，锇酸后固定。常规制作超薄切片和铀-铅染色，JEM100CXⅡ型电镜观察。
       
       将附壁爬片的癌细胞培养液中分别加药5 h，10 h后取出盖片，用4%多聚甲醛固定，常规洗涤和SP免疫组织化学染色。其操作程序按试剂盒说明书进行。阴性对照PBS代替Ⅰ抗，阳性对照为已知阳性人胃癌组织切片。
       1.3  统计学处理 
       利用彩色图像分析仪软件进行图像分析。每组随机计数100个癌细胞，以灰度表示着色深浅（深者灰度值低，浅者灰度值高）。借助SPSS软件进行方差分析，然后进行独立样本t检验。
       2  结果
       2.1  癌细胞形态的变化 
       对照组BCG-823癌细胞呈梭形、多边形；胞核呈圆形，紫蓝色，其边界清晰，核仁可见。胞质均匀，多呈弱嗜酸性。实验5 h组BCG-823癌细胞的胞质突减少，梭形细胞减少，很多细胞周围呈毛刺状，胞质空泡增多；胞核多呈固缩状态，着色较深，有些细胞核膜消失，染色体居细胞中部呈有丝分裂中期相。实验10 h组大部分癌细胞的胞质不完整，甚至消失。细胞形态畸变，少部分癌细胞胞质水肿。
       
       电镜下5 h组细胞表面微绒毛减少或消失，局部细胞器减少，主要是线粒体和游离核糖体减少，胞质中有低密度电子空泡出现，并见扩张的内质网。10 h组线粒体水肿嵴减少或消失，并有水样变；粗面内质网扩张和脱颗粒，次级溶酶体增多，有些细胞质膜断裂或缺损使胞核裸露，细胞器溢出，有些细胞核膜消失，染色体聚集于细胞中部，长短不等。
       2.2  GSTπ 免疫组织化学染色结果 
       对照组GSTπ阳性物质呈黄色，分布在胞质和突起中，以核周围区胞质处着色较深，可呈棕黄色。胞核不着色。实验5 h组许多细胞胞质着色变浅或变化不明显，而胞核着色很深呈棕黄色或棕褐色10h组胞核、胞质着色又变浅，均呈浅黄色。经彩色图象分析仪软件进行分析，凡着色越浅（含量越少）灰度值越高，而着色深者（示含量高）则灰度值越小。其结果见表1。表1  长春新碱对人胃癌细胞GSTπ表达的影响（略）
       3  讨  论
       VCR是一种广谱抗肿瘤药物，它是一种生物碱，由夹竹桃科植物长春花中提取的有效成分，是我国传统的抗癌药物之一［1］。VCR对血液病、乳腺癌、肺癌、胃肠癌和肾癌均有较好的治疗效果［2］。对其治疗机制的研究也日益深入。有报告VCR对细胞蛋白质代谢及酶活性有干扰作用。通过本实验发现VCR对GSTл基因也有明显的干扰作用。在用药5 h后，GSTл基因呈激活状态，其编码蛋白GSTл在核中含量急剧增高并与其他组比较有高度显著性差异(P<0.001)，而药物作用10 h则GSTл基因受到抑制，其GST含量明显下降，尤以胞核变化最为显著。其原因可能与VCR能够抑制RNA多聚酶活性及阻断蛋白质运转作用有关。
       GSTл具有多种功能［3，4］如催化有害物质与谷胱甘肽结合，以达到解毒作用和减轻致癌因子的作用，同时具有抗过氧化物刺激作用及参与调节某些激酶活性以阻断细胞凋亡途径等功能［5，6］。当VCR作用时间延长达10 h，将使细胞内蛋白质代谢障碍和RNA多聚酶受到抑制，从而使GST基因活性也受到抑制，GSTл蛋白含量减少进而导致细胞内毒物降解功能下降或消失。细胞内毒物的堆积必然导致细胞多种生理活性受阻。同时VCR也可直接抑制膜内蛋白质分子的合成及氨基酸在膜上的运转。因此，多种不良因素进一步导致癌细胞中膜性细胞器破坏。正如我们所见线粒体水肿、嵴消失和内质网扩张或破坏等变化，同时也见到很多细胞质膜破裂，造成细胞器外溢和细胞解体的现象。
       由于VCR可以直接与细胞骨架-微管蛋白结合，形成不可逆转的复合物［7］，从而破坏微管功能，使纺锤丝不能形成，因此在光、电镜下均可见染色体停留在细胞中部的现象（即有丝分裂中期细胞增多）。
       综上所见VCR抗癌作用与细胞基因表达失控和细胞超微结构破坏有关，而且这种破坏作用从药物接触5 h开始已经显效，10 h更加明显。本实验提示长春新碱对癌细胞的杀伤作用是多途径、多机制的复杂过程，其中对GSTл基因蛋白的影响，可能是重要途径之一。
       【参考文献】
         　　［1］卢 懿，侯世祥，陈 彤，等.长春花抗癌成分长春新碱研究的进展［J］.中国中药杂志，2003.28（11）：1006.
       
       ［2］肖春英，梁孝印，付孟莉.长春新碱临床研究进展［J］.社区医院杂志，2004，2（5）：33.
       
       ［3］Cho SG,Lee YH,ParK Hs et al .Glutathione S-traresferase mu modulate the stress-activated signals by suppressing apoptosis signal-regulating Kinase 1［J］.J Biol Chem , 2001,276(16):12749.
       
       ［4］郭桂芳，谢汝华.谷胱甘肽S-转移酶л在头颈部肿瘤中的研究进展［J］.国外医学耳鼻咽喉科学分册，2005，29（1）：15.
       
       ［5］殷志敏，刘爱华，姜勇. 谷胱甘肽S-转移酶л通过抑制ASK1-MKK7-JNK通道保护血清撤离诱导的293细胞死亡［J］.生物化学与生物物理学报，2001，33（2）：185.
       
       ［6］张鹏，朱俊杰. 耐药相关因子Pgp、GST和MT在肺癌中的表达及临床意义的研究［J］.中国肿瘤临床，2002，29（8）：596.
       
       ［7］于泳，胡劲波，尚军，等. 抗癌药长春新碱及微管蛋白的相互作用的电化学研究［J］.化学学报，2004，62（2）：137.