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       【摘要】 
       目的研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对小鼠化学性肝损伤的作用及其可能机制。方法采用在体和离体两种方法观察: 在体以D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal） 诱导小鼠急性肝损伤模型,测定各组肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT) 、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase;GOT) 活性,及肝组织丙二醛(malondialdehyde,MDA) 、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase ,XOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase , GSH-PX) 、一氧化氮(nitrogen monoxidum ,NO) 、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase ,NOS) 、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase ,iNOS) 含量。体外实验采用小鼠离体肝细胞原代培养,并建立CCl4 诱导肝细胞坏死性损伤模型,检测TMP 对其的影响。结果TMP能显著降低小鼠血清中升高的GPT，GOT，降低XOD 活力和过氧化物终产物MDA 的含量。对氧化应激引起的肝脏GSH 含量下降具有升高作用。TMP 可以显著降低离体培养中染毒肝细胞中的GPT水平。结论 提示TMP对小鼠化学性肝损伤具有显著的保护作用。
       【关键词】  川芎嗪 肝损伤 肝原代培养细胞
       川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基比嗪（Tetramethylpyrazine ，TMP）, 被广泛应用于心脑血管闭塞性疾病的治疗［1］。川芎嗪有解痉、降压、扩张血管等广泛的生物作用。川芎嗪在肝细胞方面的研究尚少见报道。有研究表明［2］，川芎嗪能减轻大鼠肠缺血再灌注所致肝脏损伤。其机制与减少大鼠脂质过氧化,改善ATPase功能有关。本实验采用了体内给药以及建立体外模型两种方法观察TMP对小鼠急性肝损伤的保护作用。在体实验主要从体内降酶和抗脂质过氧化、抑制NO等方面研究TMP对肝损伤的治疗作用。离体采用体外小鼠原代细胞模型,排除神经和体液因素的影响,观察TMP对CCl4 染毒的小鼠肝细胞的保护作用,进一步探讨TMP 及阳性对照药物的膜保护作用机制，以便为临床用药提供参考。
       1  材料与方法
       1. 1  动物　
       昆明种小鼠,雌雄兼用,体重21～24 g（荆门职业技术学院实验动物中心提供）。
       1. 2  药品与试剂　
       川芎嗪注射液40 mg/2ml，（北京第四制药有限公司生产，批号：200503020），D-半乳糖胺( D-Gal)，重庆医科大学提供，批号：051215 ，四氯化碳(CCl4 )，分析纯,南京化学试剂一厂生产，批准文号：GB32226；生化检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所提供；刀豆蛋白A (Concanavalin A , Con A ,Sigma)；噻唑蓝(MTT , Sigma)； 胶原酶(Collagenase ,475 U·mg-1) 为Sigma 产品；二甲基亚砜(DMSO , 苏州正兴化工厂) ；乙二醇- 双(α-氨基乙基)-醚-四乙酸(HEPES) 均购自和光纯药药工业株式会社。
       1.3  动物分组
       昆明小鼠随机分为5组,每组10只。分别为①正常对照组:生理盐水20 ml·kg- 1；②模型组:生理盐水20 ml·kg- 1； ③TMP高剂量组:800  ml·kg- 1；④中剂量组400 ml·kg- 1；⑤低剂量组200 ml·kg- 1，灌胃1次/d,连续给药7 d。于末次给药1 h后,除正常对照组外, 其他各组小鼠均腹腔注射10% D-Gla (800 mg·kg-1 ) 。禁食不禁水,16 h 后由球后静脉丛取血,分离血清备测GPT，GOT。处死小鼠后,取肝称重并计算肝系数(肝脏湿重与体重之比) 。
       1.4  血清酶活性测定　
       分离血清后用赖式改良法测GPT，GOT;称取肝脏总重量,测肝重系数变化。
       1.5  肝组织匀浆酶活性测定　
       用考马斯亮蓝法(试剂盒) 测定蛋白质含量,用硫代巴比妥酸法(试剂盒)测定丙二醛(MDA) 含量,用紫外分光光度法(试剂盒) 测定黄嘌呤氧化酶(XOD) 活性,用二硫双硝基苯甲酸显色法(试剂盒) 测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 活性,用硝酸还原酶法(试剂盒)测定一氧化氮(NO) 。
       1.6 肝细胞分离　　
       小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,用70%的酒精棉球消毒小鼠体表后,背位固定。再次用酒精棉球消毒其腹部,腹正中V形切口,使腹腔充分暴露,门静脉插管并固定,向肝脏灌注37 ℃预温的前灌流液( 无钙镁Hank "s 平衡盐溶液, 内含0. 5 mmol·L- 1 EGTA、25 mmol·L- 1HEPES ,pH 7.4) 。同时打开后腔静脉,尽量冲尽肝组织中残血,然后打开胸腔,剪断前腔静脉,结扎后腔静脉。再用37 ℃预温的灌流液(含0.1%胶原酶、4 mmol·L- 1CaCl2，0.8 mmol·L- 1  MgSO4 的HBSS) 继续灌流,控制流速约6 ml·min- 1，持续灌流数分钟后,待肝组织韧性消失,轻压不易恢复,停止灌流。立即将肝脏置于含完全培养基的培养皿中,用含10-6 mol·L- 1胰岛素和10 - 6 mol·L- 1地塞米松的无血清RPMI-1640 培养基冲洗2～3次后,将肝脏转入另一盛有含胰岛素和地塞米松的RPMI-1640 培养基的平皿中,用眼科镊去除肝包膜,轻轻抖动,分散肝细胞,将此肝细胞悬液用100目滤网过滤,滤液以50×g 离心2 min ,弃上清,沉淀为肝实质细胞(hepatocytes ,HC)［3］。
       1.7  CCl4 致肝损伤与转氨酶的释放实验　
       在96孔培养板中加入上述分离的肝细胞,每孔细胞数为2×104 ,于37 ℃, 5 % CO2 培养4 h, 肝细胞单层用William"s E 培养液洗涤2 次,加药预培养3 h ,弃上清,再加入CCl4 (0. 15 %) 和药物共培养2 h 或只加CCl4 培养2 h，吸取上清测谷丙转氨酶活力［4］。
       1.8  统计方法　
       用SPSS 10.0 软件包处理数据。各项数据均以表示,多组计量资料均数比较采用单因素方差分析。并进行组间两两比较,方差齐用LSD法,方差不齐采用Dunnett"s T3 法比较, P< 0.05 为差异具有统计学意义。
       2  结果
       2.1  DGLL 对D-Gal 所致肝损伤小鼠血清酶水平的影响　
       与对照组相比,模型组的肝脏指数有极显著的增加(P < 0.01)TMP高、中剂量组使升高的肝脏系数极显著地降低(P< 0.01)。与模型组相比,TMP高、中剂量组小鼠血清中GPT ，GOT水平均显著下降(P< 0.01)。结果见表1。表1  TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠血清酶水平的影响(略)
       2. 2   TMP 对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、XOD 和GSH 水平的影响　
       模型组肝匀浆MDA水平及XOD活力与正常组相比明显升高 (P< 0.01) ,TMP高、中、低剂量组中,肝匀浆MDA水平明显降低 (P< 0.01)，TMP高、中、低给药组动物肝匀浆中XOD活力与模型组相比, 明显降低；与对照组相比,模型组肝匀浆GSH 水平也明显降低 ( P< 0.01) , TMP高、中剂量组升高肝匀浆中降低的GSH 活力, TMP低剂量给药组未见明显效果。结果见表2。表2  TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中MDA，XOD 和GSH水平的影响(略)
       2.3  TMP对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中NO，NOS和iNOS水平的影响　
       模型组肝匀浆NO，NOS，iNOS 水平与正常组相比明显升高(P<0.01)， TMP高，中剂量组均可显著降低肝匀浆中升高的NO，NOS，iNOS 含量，TMP低剂量组未见明显作用。见表3。表3  TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中NO，NOS 和iNOS 水平的影响（略）
       2.4  形态学观察　
       对照组肝细胞形态无明显改变,细胞界限清晰。CCl4 损伤后,肝细胞经台盼蓝染色显示,细胞活性明显降低,在显微镜下,可见细胞膜不规则,有皱缩现象TMP组及各给药组细胞形态明显好于模型组。
       2.5  DGLL 对CCl4 损伤肝细胞GPT的影响　
       CCl4损伤肝细胞后,促进肝细胞内酶的释放,模型组的GPT 水平较对照组明显升高。与模型组相比TMP各剂量组均能显著抑制GPT水平的升高, 在与上述相同的浓度下,均可剂量依赖性地降低GPT浓度。见表4。表4  TMP对CCl4 损伤肝细胞ALT的影响(略)
       3  讨 论
       体内实验中采用D-Gal腹腔注射导致小鼠急性肝损伤,实验中模型组小鼠血清GPT，GOT 水平明显升高,与正常对照组比较均有明显改变,提示本实验造成了小鼠急性肝损伤［5］。本实验结果表明，TMP可降低产生氧自由基酶系的活力,如可降低XOD 活力和过氧化物终产物MDA 的含量。MDA 可间接反映机体细胞受自由基攻击的程度,显示细胞损伤的程度。同低剂量组相比高剂量组降低MDA的含量优于低剂量组,提示TMP高、中剂量较低剂量具有更强的减轻脂质过氧化反应的作用,减轻过氧化作用对细胞膜，RNA 和蛋白质等的攻击,从而改善由过氧化反应引起的肝损伤［6］。GSH广泛存在于人体的各种组织中。GSH 水平降低意味着机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应,因此自由基生成大量增加。从本实验可以看出,与对照组相比,模型组肝匀浆GSH 水平显著降低,提示在肝脏化学性损伤时,氧化应激消耗GSH引起肝脏GSH 含量下降,机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应,因此自由基生成大量增加。TMP处理后肝脏GSH 之所以明显高于肝损伤组。可能与下述机制有关：①减轻氧化应激的程度使其低于肝损伤模型组; ②增强组织、细胞的抗氧化能力,减弱氧化应激反应导致的肝损伤。本实验用D-Gal 致急性肝损伤后,模型组肝匀浆iNOS 水平与正常组相比显著升高,同时模型组肝匀浆NO水平也明显升高,这些主要由iNOS 诱导产生的NO 在肝损伤中主要起毒性作用。本实验结果提示TMP 组显著降低肝匀浆中升高的NO ,从而减轻肝脏组织中高水平的NO 对肝组织的毒性作用,且TMP 高剂量组较中剂量组小鼠肝组织中NO浓度进一步降低,提示TMP对肝组织中NO 浓度降低在一定范围内与剂量呈正相关。CCl4 中毒引起的动物GPT升高水平与肝细胞损伤程度呈平行关系［7］，转氨酶升高在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度［8］。本实验中我们采用原代培养肝细胞的方法,建立了CCl4 诱导肝细胞坏死性损伤模型。CCl4 染毒2 h ,表明CCl4 是通过早期溶膜作用而破坏膜结构,细胞膜受损,通透性增加,细胞内GPT，K+ 顺浓度梯度而漏出。分离正常小鼠的HC ,预培养后加入不同浓度的药物共培养4 h ,洗去药液后加入CCl4共培养。结果与HC 的GPT 自动释放值相比,CCl4 加入后引起原代肝细胞损伤,导致HC 释放GPT显著增加,而TMP及各组药物对CCl4 引起的肝细胞损伤均呈现不同程度的保护作用,有明显的量效关系。提示：TMP具有抗CCl4 损伤小鼠肝细胞后的脂质过氧化作用和脂质膜稳定作用。有保护肝细胞和溶酶体膜结构作用。
       综上所述, TMP在降酶、抗脂质过氧化、抑制细胞因子NO等方面都表现出了很重要的作用。同时体外实验排除了TMP通过神经和体液因素所起的间接作用,从细胞水平证实TMP对CCl4所致的肝脏损伤有一定的保护作用。
       【参考文献】
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