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       【摘要】 
       目的从甘草不同组织中提取高质量的RNA，为进一步合成双链cDNA，构建甘草cDNA文库奠定基础。方法采用几种常用方法(高盐溶液法、LiCl沉淀法、CTAB法和SDS法)提取甘草不同组织的RNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳和A260/A280，A260/A230的值作为指标。结果LiCl沉淀法对于甘草不同组织中的RNA具有更好的提取效果，条带清晰，完整性较好，且A260/A280和A260/A230值均接近于2.0，根部组织产量达0.220 μg/mg，叶片组织产量达0.275 μg/mg。结论采用LiCl沉淀法提取甘草不同组织中的RNA具有更好的效果，适于从富含多糖的植物组织中提取RNA。
       【关键词】  甘草 RNA提取 多糖
       The Methods of RNA Extraction of Radix Glycyrrhizae
       ZHANG Hui， WANG Wenquan，YANG Quan
       1.School of Pharmacy, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China;
       2.Department of TCM, Guangdong College of Pharmacy , Guangzhou 510006, China
       Abstract:ObjectiveTo isolate the high quality RNA from different tissues of Radix Glycyrrhizae efficiently so as to lay a foundation to synthesize the cDNA and construct the cDNA library. MethodsTotal RNA was isolated from different tissues of Radix Glycyrrhizae by some familiar ways, such as high-salt solution, lithium chloride sedimentation, CTAB and SDS. Use 1% agarose gel electrophoresis and UV numerical value of A260/A280 and A260/A230 as the standard.ResultsThe method of lithium chloride sedimentation had the best effect to extract total RNA from different tissues, the bands were clear on agarose gel and the gritty of RNA was good. The ratios of total RNA A260/A230 and A260/A280 were close to 2.0, respectively. The yield of the root was 0.220 μg/mg fresh weight, and the leaf was up to 0.275μg/mg fresh weight. ConclusionThe method of lithium chloride sedimentation has the best effect to extract total RNA of different tissues, and this method is also applicable to the plants with much amylase.
       Key words:Radix Glycyrrhizae；  RNA extraction；  Amylase
       甘草(Radix Glycyrrhizae)是一种富含多糖的中药材，临床应用广泛。随着甘草分子研究的不断深入，探索快速而有效的RNA提取方法，从甘草不同组织中获得高质量的RNA成为了研究的关键，也为进一步的研究如构建cDNA文库，RT-PCR，Northern杂交、基因芯片等奠定基础。有关植物RNA的提取方法已有不少报道［1］，但由于植物组织具有多样性，在实际应用中需要摸索出适应自身研究的植物材料的RNA提取方法。
       本实验通过对比高盐溶液法、LiCl沉淀法等4种常用的植物RNA提取方法，对甘草不同组织的RNA进行分离研究，从而找到高效、简便、适用于甘草不同组织的RNA提取方法。
       1  材料与方法
       1.1   材料一年生甘草的叶片和根部组织。用0.1%生理盐水洗净，用干净吸水纸擦干，分成1 g/份存于离心管中，于液氮中迅速冻存，然后转入-70℃冰箱保存。
       1.2   方法
       1.2.1  高盐溶液法分别取叶片和根组织各1 g，放入研钵中，加入液氮研磨成细粉，加入10 ml的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5)，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)，4 mol/L异硫氰酸胍，5%的β-巯基乙醇，2% PVP），静置，待抽提缓冲液缓慢融化，用力研磨，直至分散混匀，分装在4个10 ml离心管中。12 000 g离心5 min，取上清液，加入1 ml氯仿，混匀，12 000 g离心10 min。取上清液，加入等体积的异丙醇和等体积的高盐溶液（1.2 mol/L NaCl，0.8 mol/L柠檬酸三钠），静置10 min 12 000 g离心30 min，弃去上清，沉淀用75%乙醇洗涤，自然干燥，用50μl无RNase水溶解，-70℃保存。
       1.2.2  LiCl沉淀法分别取叶片和根组织各1 g，放入研钵中，加入液氮研磨成细粉，转入4个10 ml的离心管，分别加入3 ml抽提缓冲液（0.75 mol/L 柠檬酸钠溶液 (pH 7.0)，10%(m/V) N-月桂肌氨酸钠溶液，100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，4 mol/L异硫氰酸胍，5% β-巯基乙醇，2% PVP），混匀，冰浴30 min，23 000 g离心20 min。吸取上清液，依次加入0.4ml 2mol/L NaCl，4ml苯酚，0.8ml氯仿:异戊醇(49:1)，混匀，冰浴15 min，23 000 g离心20 min。取上清液，加入等量的KAc溶液，冰浴30 min，23 000 g离心20 min。吸取上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置45 min，混匀，23 000 g离心20 min。弃上清液，用75%的乙醇洗涤沉淀，自然干燥。加入400 μl DEPC水溶解沉淀，移至1.5ml离心管，加入100 μl 10mol/L LiCl，4℃放置3 h，12 000 g离心20 min。用75%乙醇洗涤沉淀，自然干燥，用50 μl无RNase水溶解，-70℃保存。
       1.2.3 CTAB法分别取叶片和根组织各1g，放入研钵中，加入液氮研磨成细粉，转入4个10 ml的离心管，加入1ml提取缓冲液（2%CTAB，2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L EDTA，20 mmol/L NaCl，2%β-巯基乙醇），65℃水浴10 min，12 000 r/min离心5 min。取上清液，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25∶24∶1），混匀，12 000 r/min离心5 min。将上清液转移到新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，12 000 r/min离心5 min。将上清液转移到新的离心管中，加入2倍体积预冷的100%酒精，冰浴放置10 min，12 000 r/min离心5 min。弃上清液，用75%乙醇洗涤，自然干燥，用50μl无RNase水溶解，-70℃保存。
       1.2.4  SDS法分别取叶片和根组织各1 g，放入研钵中，加入液氮研磨成细粉，转入4个10 ml的离心管，加入1ml预热的提取缓冲液（100 mmol/L LiCl，100 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA，1%SDS，2%PVP），混匀，冰浴10min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，加入等体积氯仿，充分混匀，冰浴10 min，12 000 r/min离心15 min。取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置1 h， 12 000 r/min离心15 min。弃去上清液，75%乙醇洗涤，自然干燥，用50 μl无RNase水溶解，-70℃保存。
       2   结果
       2.1  RNA的产率和纯度分别应用4种方法对甘草的叶片和根部组织的RNA进行了提取，产率和纯度结果见表1，其中所列数据均为平均值。表1  不同方法提取甘草不同组织的产率和纯度分析（略）
       理论上，对于较纯净的RNA其A260/A280和 A260/A230均应接近2.0，A260/A280过低会有蛋白质的污染，A260/A230过低会有大分子多糖的污染。由表1中数据可以看出，CTAB法和SDS法虽然可以去除小分子杂质和蛋白的污染，但是提取的总RNA的含量较低，相比之下利用高盐溶液法和LiCl沉淀法提取总RNA的产率较高。但是因为甘草组织富含多糖，应用高盐溶液沉淀RNA的同时也将大分子的多糖沉淀下来，虽然产率较高，但是多糖污染严重，将得到的RNA溶液离心能够在管底富集大量的胶状物，影响下一步操作。因此，LiCl沉淀法具有较好的提取效果，A260/A280和 A260/A230接近2.0，且产量较高，叶片及根部组织均达到0.2 μg/mg以上。
       2.2  RNA的完整性分别应用4种方法对甘草的两个组织的RNA进行了提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的完整性，具体结果见下图1，2。由图中可以看出，S1和S2的方法提取的总RNA完整性较好，即高盐溶液法和LiCl沉淀法对于甘草叶片及根部组织均具有较好的提取效果。
       3  讨论
       3.1  RNA提取需要注意的问题实验过程中要严格控制无酶的环境，所用试剂都需要灭酶处理，实验人员要带一次性手套和口罩，整个过程尽量在超净台工作，超净台要提前30 min用紫外灯照射消毒，以减少RNase的污染。液氮研磨过程中要研磨彻底，否则影响细胞的破裂完全，提出的RNA量少或提不出。
       3.2  防止酚类氧化甘草含有大量酚类化合物，在提取过程中十分容易氧化，导致提取过程中组织颜色逐渐加深变成红棕色，严重影响了所提的RNA的质量，其主要原因是由于酚类化合物氧化后不可逆地结合到核酸上并与RNA共沉淀［2］。为解决酚类氧化问题，用PVP和β-巯基乙醇作为还原剂［3］，能够提高RNA的质量，减轻氧化而产生的背景颜色。
       3.3  克服多糖污染甘草富含多糖，尤以根组织中多糖含量较多，在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用，形成难溶的胶状物与RNA共沉淀下来，给提取RNA带来了很大的难度。这也是富含多糖植物进行分子生物学操作中常见的难题。
       本实验首先在K+离子存在的情况下，用预冷的(-20℃)异丙醇沉淀RNA，进一步用高浓度的LiCl重沉RNA，达到除去多糖的目的。本方法适用于从含糖量高、黏度大或表达丰度较低的植物组织中提取总RNA，尤其适用于根类组织，为从富含多糖的根类组织中提取RNA提供了依据。
       【参考文献】
         　　［1］Fang G, Hammar S, Grnmet R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA［J］.Biotechniques, 1992(13):52.
       
       ［2］Schneiderbauer A H, Sandermann J, Ernst D. Isolation offunctional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds［J］.Anal Biochemistry, 1991, (197):91.
       
       ［3］唐明娟, 郭顺星. 金线莲RNA提取方法的改进［J］.中草药, 2002, 33(10):937.