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       【摘要】 
       目的探讨桂西生姜总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基清除作用，以充分利用桂西生姜植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从桂西生姜中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用桂西生姜总黄酮对羟自由基清除作用进行实验。结果测得样品中总黄酮的含量C=0.9573 mg/ml，回收率为101.8%，其纯度和产率均较高。结论 该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取桂西生姜黄酮类物质的有效途径。桂西生姜总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用。
       【关键词】  超声波提取 生姜 总黄酮 鉴别 自由基 清除
       Extraction of Total Flavanone from Guixi"s Zingiber officinale Roecoe and Its Effects on Scavenging of Hydroxyl Radicals
       YANG Shaoliang，MENG Chunyue，LUO Jianhua，ZHANG Lidan，FENG Ling，PAN Longji， HUANG Suoyi
       1. Baise Agricultural School, Baise, Guangxi 533000, China;
       2. Youjiang Medical College for Nationalities, Baise 533000，China
       Abstract：ObjectiveTo make use of the resources of Guixi"s Zingiber officinale Roecoe,avoid wasting and approach the extraction of total flavanone of Guixi"s Zingiber officinale Roecoe and to study its effects on scavenging of hydroxyl radicals.MethodsThe flavonoids were extracted by ethanol as the solvent from Guixi"s zingiber officinale roecoe with ultrasonic wave and ethanol extraction.Using spectrophotometry to extract and check the flavanone of Guixi"s Zingiber officinale Roecoe．The effect of extracts on Guixi"s Zingiber officinale Roecoe scavenging of hydroxyl radicals was studied．ResultsBy this method the density of the total flavanone of Guixi"s Zingiber officinale Roecoe was C=0.9573 mg/ml and the rate of recovery was 101.8%.ConclusionThe outcome and the purity of the flavanone by the extraction and purifying methods are all very high .The methods are purely physical processes and have not any pollution. It is an ideal way to extract the flavanone of Guixi"s Zingiber officinale Roecoe. Total flavanone from Guixi"s Zingiber officinale Roecoe have effects on scavenging of hydroxyl radicals.
       Key words：Ultrasonic wave treatment；  Zingiber officinale Roecoe；  Total flavanone；  Identification；  Hydroxyl radical；  Scavenging
       
       生姜是姜科植物姜Zingiber officinale Roecoe的新鲜根茎，又名地辛、百辣云，系姜科多年生宿根草本植物的根茎，是一种被广泛应用的药食两用植物，既是调味佳品，可以去鱼肉腥味，也是工业上提取香精的重要原料，更是宝贵的中药材(生姜、鲜姜汁、生姜皮，以及加工炮制后煨姜、炮姜、姜炭等都是治病常用的药)，能够抵御百邪［1］。原产于太平洋群岛，我国中部、东南部至西南部广为栽培，资源丰富［2］。生姜性辛热，具有温中逐寒、回阳通脉的功效［3］。其有辣味香气，有刺激味，能增强食欲，兴奋胃肠平滑肌和呼吸中枢，有促进消化液分泌的作用［3］。其主要成分为姜烯、姜醇、没药烯、 一姜黄烯、甲基庚烯酮等［3］。早期的药理实验证明，生姜具有发表、散寒、止呕、开痰之功效，用于治疗伤风感冒、咳嗽多痰、胃寒呕吐等症［3］。现代科学证实，生姜具有抗衰老、抗肿瘤、降血脂、促进血液循环、调解中枢神经、消炎抗菌等作用［3］。
       目前国内外对生姜的黄酮类物质的研究还相当的缺乏。黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无副作用，并以此开发出多种药品和保健食品［4］。笔者曾用乙醇提取法提取桂西生姜总黄酮，但提取效率仍较低。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道［5，6］，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响［6］，但超声技术应用于提取桂西生姜中黄酮类物质的研究尚未见报道。为此，本文报道用超声波乙醇浸提法提取桂西生姜总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基的清除作用。现报道如下。
       1  仪器与试剂
       1.1  仪器
       KQ5200DB型数控超声波清洗器（超声工作频率40KHz、江苏省昆山市超声仪器有限公司）；UV-755B紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
       1.2  试剂
       95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；三氯化铝AR；盐酸AR；氨水AR；冰醋酸AR；醋酸乙酯AR；乙酸镁AR；甲醇AR；镁粉AR；正丁醇AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；新鲜桂西生姜采自广西百色市。
       2  方法与结果
       2.1  总黄酮成分提取 取新鲜桂西生姜，烘干，粉碎。称取桂西生姜粉末6 g，加80 ml 95%乙醇，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加80 ml 95%乙醇，超声波提取2.5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩5～7 ml左右为止，放置100 ml容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。
       2.2  测定方法
       依据以芦丁为对照品测定桂西生姜中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。
       2.3  定量实验-总黄酮的含量测定
       2.3.1  波长的选择
       取样品液适量，在0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在420～700 nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510 nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。
       2.3.2  标准曲线的绘制
       分别精密吸取芦丁对照液（0.10 mg/ml）0.00，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10.00 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.30 ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白参比液，于510 nm处测吸光度。结果见表1。表1  紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度结果（略）
       根据上表得回归方程：A=-0.0311+13.5184C，r=0.9999。
       2.3.3  提取物含量的测定精密吸取样品液0.50 ml，置10 ml容量瓶，按标准曲线的制备方法测定吸光度A=0.616，根据回归方程：A=-0.031 1+13.518 4C，计算样品中总黄酮的含量C=0.957 3 mg/ml。
       2.3.4  回收率实验精密量取样品液1.00 ml，加入标准芦丁对照品1.00 ml（0.10 mg/ml），同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为101.8% 。
       2.4  定性实验-总黄酮的鉴别
       2.4.1  颜色反应
       紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏0.5 min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。
       三氯化铝反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加１％三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。
       乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。
       盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1 ml于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1次加入），在泡沫处呈紫红色。
       2.4.2   纸层析 
       取样品溶液10 μl点在滤纸上。用正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5（体积比）为展开剂，上行展开5 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。
       2.5  总黄酮提取物对·OH的清除作用参照Fenton反应的方法建立反应体系模型［7］，利用H202与Fe2+ 混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。反应式如下：H202+ Fe2+ →Fe3++·OH+OH- 该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+l ml，9 mmol/L 1ml水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的桂西生姜总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在510 nm处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮)对·OH的清除作用，其清除率计算公式：
       清除率(％)=  A0-AχA0×100%
       以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到50 ml分别测其对·OH的清除作用。从图1中可看出，桂西生姜总黄酮提取液对由Fenton体系产生的·OH有很好的清除作用，随着桂西生姜总黄酮提取液浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。
       3  讨论
       实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为101.8%。利用本文所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高，提取率是乙醇提取法（非超声波）的36倍。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。
       黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等［4］。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、预防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎、镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［8,9］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。桂西生姜资源丰富。本文实验结果表明，桂西生姜中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此，桂西生姜具有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。
       【参考文献】
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