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       【摘要】 
       目的研究虎杖浓缩片对四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤的影响。方法虎杖浓缩片连续给予小鼠7 d(2.50，1.25，0.25 mg/kg)，用CCl4造成急性肝损伤，测定各组小鼠血清中ALT和AST的活性以及检查肝组织的病理改变。结果虎杖浓缩片能显著降低CCl4肝损伤小鼠的ALT(P＜0.01)和AST(P＜0.01)，减轻肝组织变性、坏死程度，缓解肝脏病理改变。结论 虎杖浓缩片对CCl4所致小鼠肝损伤具有保护作用。
       【关键词】  虎杖 片剂 保肝损伤 四氧化碳
       Protective Effects of Concentrated Tablet of Polygonum cuspidatum on Experimental Acute Liver Injury Induced by CCl4
       LIU Dan, TANG Haifeng, ZHANG Sanqi, DING Yu, MENG Jin, WANG Jingwen
       1. Department of Pharmacy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi"an 710032, China;
       2. 214 Hospital of PLA, Dalian 116013, China; 3. General Hospital of PLA, Beijing 100853, China
       Abstract：ObjectiveTo analyze the effects of concentrated tablet of Polygonum cuspidatum on liver injury of mice induced by CCl4. Methods After administrating concentrated tablet of Polygonum cuspidatum (2.5 mg/kg, 1.25 mg/kg, 0.25 mg/kg) for 7 days consecutively, the mice were given CCl4 to lead to acute liver injury. The activities of serum ALT  and AST, as well as the pathological changes of the liver were determined in all groups. Results The concentrated tablet of Polygonum cuspidatum inhibited the rise of hepatic ALT (P＜0.01) and AST (P＜0.01). Degeneration and necrosis of liver tissues were relieved. Conclusion Concentrated tablet of Polygonum cuspidatum method has protective effect on liver injury of mice induced by CCl4.
       Key words：Polygonum cuspidatum;  Tablet;  Liver injury;  Carbon tetrachloride
       中药虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎及根，收载于《中国药典》2005年版Ⅰ部，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。虎杖主要含二苯乙烯类和蒽醌类化合物［1］，其中前者主要为白藜芦醇和白藜芦醇苷(虎杖苷)，具有降血脂、保肝等多种药理作用［2］；后者以大黄素、大黄素甲醚为代表，具有抗菌、保肝等功能［3］。临床上以虎杖为主药的制剂种类繁多，对虎杖制剂的提取工艺也有较多报道［4，5］，但多为粗提取液，成分复杂，制剂体积较大。为减少服用剂量、便于服用和携带，作者前期已对其有效成分进行了富集和分离，制备了总有效部位，并且经处方优化和制备工艺研究制备了总有效部位片剂(虎杖浓缩片，concentrated tablet of Polygonum cuspidatum， CTPC)，现报道该片剂对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用，为开发廉价有效的治疗化学性肝损伤制剂提供实验依据。
       1  器材
       1.1  药物 
       虎杖购于西安市药材公司(产地陕西)，经第四军医大学西京医院副主任药师汤海峰鉴定；大黄素和大黄素甲醚对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为0756-200110和758-9904)；白藜芦醇对照品(Sigma公司，Prod. No. R5010, CAS No. 501-36-0)；白藜芦醇苷对照品(第四军医大学化学教研室自制，经面积归一化测定纯度在99%以上，批号0503047)；D101大孔树脂(西安蓝深交换吸附材料有限公司)；解毒降脂片(四川巴中普瑞制药有限公司，批准文号：国药准字Z51021201，批号050605，每片重0.58 g，相当于原生药2 g)。
       1.2  动物 
       昆明种小鼠，体重(18±2) g，♀♂各半，由第四军医大学实验动物中心提供。实验动物合格证号：SCXK (军)2002-005。
       1.3  试剂 
       ALT试剂盒(批号060401)、AST试剂盒(批号060181)，均为中生北控生物科技股份有限公司产品、四氯化碳(天津市化学试剂二厂，批号001018)。
       1.4  仪器 
       LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津)； UV-265紫外分光光度计(日本岛津)；电子分析天平(德国赛多利斯)；电热鼓风干燥箱(上海华连医疗器械有限公司)；超声波清洗器DL-360A(上海之信仪器有限公司)；TGL-16C离心机 (上海安亭科学仪器厂)，光学显微镜(OLYMPUS,HE20 )；生化自动分析仪(日本日立7170A型)。
       2  方法
       2.1  虎杖浓缩片的制备 
       虎杖粗粉用5倍量70%乙醇在90℃下加热回流3次，2 h/次，合并提取液，减压回收乙醇后加水至适宜浓度，即为虎杖粗提液，体积约为原药材的5～10倍量；粗提液1 BV，加入处理好的D101树脂柱，吸附流速2.4 BV/h，上样后静置30 min，先用2 BV水洗涤，再用20%，50%，70%，95%乙醇各2, 5, 2, 5 BV进行梯度洗脱，流速2 BV/h，合并50%和95%乙醇洗脱液，浓缩，蒸干，即为总有效部位，作为主药备用；主药195 g，乳糖80 g，微晶纤维素100 g，羧甲基纤维素钠20 g，分别过80目筛，混合均匀，加95%乙醇制软材，16目网制粒，在60℃温度下干燥，整粒后加入硬脂酸镁2 g，混匀，压成1 000片，即为虎杖浓缩片，每片重0.4 g，相当于原生药2 g。
       2.2  给药方法 
       小鼠60只，随机分为6组，正常对照组、造模组、阳性对照组［解毒降脂片给药折合成生药2.50 g/(kg·d)］、CTPC 3个剂量组［给药折合成生药2.50， 1.25和0.25 g/(kg·d)］。阳性对照组和CTPC组按10 ml/kg体重给药，每天ig 给药1次，均于实验6 d给药后1h，除正常对照组给等容量生理盐水外，其余各组动物腹腔注射0.1% CCl4 /花生油溶液(10 ml/kg)复制CCl4肝损伤模型［6，7］，禁食，待17 h后再给药，1 h后，全部小鼠摘眼球取血，离心，分离血清，用诊断试剂盒测定血清ALT、AST。采血后迅速解剖，取出肝脏，在同一肝小叶上取一小块肝组织，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，并在光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。
       2.3  统计学处理
        
       运用SPSS10.0统计软件，计量资料用±s表示，各组样本两两之间比较用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学显著性。
       3  结果
       3.1  虎杖浓缩片对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT，AST的影响结果见表1。表1  虎杖浓缩片对CCl4诱导的急性损伤小鼠血清中ALT，AST的影响(略)
        实验结果表明，小鼠腹腔注射CCl4诱导后24 h，与正常组相比，CCl4损伤组动物血清ALT和AST活性显著升高(P＜0.01)；虎杖浓缩片高、中、低剂量组血清ALT和AST明显低于CCl4损伤组(P＜0.01)，高剂量组与解毒降脂片组相比无显著性差异。CTPC能明显减轻CCl4引起的肝损伤，高剂量尤为突出，其作用与解毒降脂片相当。
       3.2   肝组织学检查正常对照组肝脏外观轮廓、颜色正常，肝组织病理观察，肝细胞浆均质状嗜伊红染质，肝细胞大小一致，胞膜完整，肝细胞排列成索状，见图1；CCl4造模组肝脏外观明显肿胀，颜色呈灰白色，肝组织病理切片观察，肝小叶结构破坏，肝表面有一带区域，肝组织直接接触CCl4造成肝细胞变性坏死，见图2；阳性对照组能使上述病理损伤呈不同程度的明显减轻，肝细胞浆内较多散在分布小空泡变性，见图3；CTPC高剂量组肝小叶结构基本完整，仅见个别细胞浆内小空泡变性，见图4。
       4  讨论
            
       CCl4肝损伤动物模型是研究护肝药物最常用的病理模型之一。CCl4进入体内经肝药酶P-450激活，产生自由基，与肝细胞生物膜上的脂质起过氧化反应，生成脂质过氧化物，同时引起Ca2＋的内流，使细胞膜结构和功能受到破坏，导致肝细胞中ALT，AST释放入血，使血中ALT，AST升高［8］。本实验CCl4处理小鼠血清ALT，AST均显著升高，表明此时小鼠肝细胞已经损伤，模型复制成功。病理学检查证实CCl4肝损伤造模组有不同程度的肝细胞变性坏死。已知解毒降脂片是虎杖粗提物制剂，而虎杖的主要成分又具有保肝功能，所以解毒降脂片对肝损伤动物模型和乙肝患者的肝脏有保护作用，我们以解毒降脂片作为阳性对照。CTPC是对虎杖粗提物进行纯化所制得的总有效成分制剂。研究结果表明，用CTPC治疗的小鼠血清ALT，AST较模型组显著性降低，且呈剂量相关性，其中高剂量组与解毒降脂片组无显著性差别，从病理组织学检查结果看，高剂量组稍优于解毒降脂片组，能明显减轻小鼠肝脏的病理损伤，表明CTPC在缩小剂量的情况下同样能够减轻CCl4对肝细胞的急性损伤，并且其减轻CCl4对肝脏结构损伤方面优于解毒降脂片。由此证明，CTPC在减少了服用剂量的情况下，治疗效果相当于解毒降脂片，对肝脏具有保护作用。
       【参考文献】
         　　［1］王忠壮, 胡晋红. 现代中药学［M］.上海：第二军医大学出版社, 2006：344.
       
       ［2］朱立贤, 金征宇, 陶冠军. HPLC测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量［J］. 中成药，2005，27(8): 944.
       
       ［3］刘树兴, 程丽英. 虎杖有效成分的开发现状及展望［J］.中国食品添加剂， 2004, (6)：80.
       
       ［4］刘树兴, 程丽英, 杨大庆. 虎杖中白藜芦醇与大黄素的综合提取［J］.天然产物研究与开发，2005, 17(5): 632.
       
       ［5］赵瑞芝, 袁小红, 丘小惠, 等. 均匀设计法优选虎杖提取工艺［J］.中国医院药学杂志, 2006, 26(1)：17.
       
       ［6］王汝涛，周四元, 张 峰，等. 阿魏酸乙酯减轻四氯化碳致小鼠急性肝损伤［J］.中国药理学通报，2004，20﹙10﹚：1196.
       
       ［7］刘蕾，李丽, 张蕊，等. 虎杖对小鼠CCl4性肝损伤的保护作用［J］.黑龙江医药科学, 2001,24(3):20.
       
       ［8］唐云安，刘玉清，王国清. 肝损伤动物模型研究进展［J］.卫生毒理学杂志，2002，16（4）：236.