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       【摘要】 
       目的研究煎煮时间及甘草剂量对附子中酯型生物碱含量的影响。方法采用紫外分光光度法测定附子中的酯型生物总碱含量；采用高效液相法比较乌头碱和次乌头碱的含量。结果酯型生物碱含量的降低，与煎煮时间和甘草剂量有较高的相关性；煎煮时间超过30 min，100 g制附子煎煮液所含的乌头碱和次乌头碱含量低于2 mg/ml。结论 大剂量附子用药必须通过合理煎煮和配伍以降低毒性，发挥其特长。
       【关键词】  附子 煎煮时间 甘草 生物碱
       Effect on the Contents of Ester-type Alkaloids in Radix Aconiti Laterlis Preparata by Different Decocting Time and Compatibility Dosage of Radix Glycyrrhizae
       QIU Xiaohui,  HE Jie
       (The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of TCM, Guangzhou, Guangdong, 510120 ，China)
       Abstract:ObjectiveTo study the effect on ester-type alkaloids in Radix Aconiti Laterlis Preparata by different decocting time and compatibility dosage of Radix Glycyrrhizae.MethodsTo determine the content of ester-type alkaloids with ultraviolet spectrophotometry (UV). To determine the contents of aconitine and hypaconitine High Performance Liquid Chromatogram (HPLC). ResultsThere was higher correlation between the contents of ester-type alkaloids and decocting time, or compatibility dosage of Radix Glycyrrhizae. When the decocting time was over 30min, the contents of aconitine and hypaconitine were lower than 2mg/ml in the decoction with a dosage of 100g. ConclusionIn order to decrease the toxic, and reduce the specialty of Radix aconiti laterlis preparata with a large dosage, the reasonable decocting time and compatibility are imperative.
       Key words:Radix Aconiti Laterlis Preparata;  Decocting time;  Radix Glycyrrhizae;   Compatibility；  Alkaloids
       附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeli Debz 的子根加工品［1］，是中药首选的温里药，具有温经止痛、温中散寒、回阳救逆、温阳扶正等功效，适用于阳虚阴盛，急危厥脱症，与其它中药灵活配伍使用，可治疗多种疾病。《中国药典》附子饮片规定剂量为3～15 g。但附子之大剂量应用古已有之，唐代《千金要方》就有记载用附子达4两者（合今约130 g），现代一些名老中医也擅长用大剂量附子在临床取得显著疗效［2］。但同时，不少医家因畏其毒性不敢应用，或用之不当反致中毒。
       现代研究表明［3］附子含多种化学成分，其主要有效成分为生物碱类，毒性成分主要为二萜类双酯型生物碱，如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱。经炮制加工后其中酯型生物碱被部分除去或水解，而毒性低的乌头原碱含量则增加。因附子为毒性中药，即使经过炮制，大剂量应用仍存在一定风险。临床用药一般通过长时间煎煮和配伍用药减低附子毒性，其中与甘草配伍较为普遍，但随着毒性减低，药理活性亦随之递减。因此，如何通过合理煎煮和配伍以降低毒性，并最大限度地发挥其特长，有重要的临床意义。
       本研究通过采用紫外分光光度法测定附子中的酯型生物碱含量，研究煎煮时间及甘草剂量与附子中酯型生物碱含量的相关性。同时，参照《中国药典》［1］（Ⅰ部）正文附子项下乌头碱限量检测方法，采用高效液相法比较不同煎煮时间大剂量附子提取液中乌头碱和次乌头碱含量，从附子大剂量用药的安全和有效角度，初步为临床用药提供依据。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器Waters高效液相色谱仪（996二极管阵列检测器、600泵、2010数据处理软件）；紫外-可见光分光光度仪(美国发玛西亚公司,B20-RAD UV/V 4000型)；薄膜旋转蒸发仪（上海申科仪器设备厂）。
       1.2  材料和试剂制附子、甘草购自本院药学部，为《中国药典》（Ⅰ部）收载品种。乌头碱（批号0720-9807）、次乌头碱（批号798-9403）购自北京生物制品检定所。所用试剂为色谱纯或分析纯。
       2  方法与结果
       2.1   酯型生物总碱的含量测定［4］
       2.1.1  标准曲线的制备
       标准溶液配制：精密称取乌头碱标准品5.1 mg，加1mol·L-1HCl溶液4滴溶解，加纯水稀释，加1 mol·L-1NaOH水溶液4滴，混匀，定容至10 ml，备用。
       
       测定波长选择：精密量取乌头碱标准品溶液0.10  ml，置于60 ml分液漏斗中，加水2.90 ml，再加入醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=6.0）5.0 ml，溴麝香草酚蓝指示液2.0 ml，最后精密加入10.0 ml氯仿，振摇3 min，静置1 h，氯仿层用脱脂棉过滤，弃初滤液，收集续滤液。以不含乌头碱的试剂空白同法操作作参比，于400～700 nm波长之间进行扫描，测得最大吸收波长为410 nm。
       标准曲线制备：分别量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml乌头碱标准品溶液，加纯水至3.0 ml，按前“测定波长选择”项下方法操作，于410 nm处测定吸收度，计算回归方程为：Y=2.668 8X-0.375 5，r=0.997 5，线性范围1.02～6.12   mg。
       2.1.2  供试样品的制备制附子原药（不煎煮）供试样品的制备:按《中国药典》（Ⅰ部）正文附子项下乌头碱限量检查供试品制备方法同法操作制备：取制附子粗粉20.0 g，置具塞锥形瓶中，加乙醚150 ml，振摇30 min，放置1～2 h，分取醚层，蒸干，残渣加1 mol·L-1HCl溶液4滴溶解，加纯水稀释，再加1 mol·L-1NaOH水溶液4滴，混匀，定容至10 ml，备用。
       
       制附子单煎供试样品的制备：取制附子粗粉100 g共4份，分别加水煎煮30，60，90，100，120 min，煎煮液用脱脂棉过滤，滤液用旋转蒸发仪于75℃左右在水浴上浓缩至100 ml。量取煎煮液20.0 ml，用氯仿萃取5次，10 ml/次，合并氯仿液，蒸干后按前“制附子原药（不煎煮）供试样品的制备”项下方法操作，得供试样品。
        
       附子与甘草合煎供试样品的制备：取制附子粗粉120 g共6份,分别与甘草12，20，40，60，80，120 g配伍，合煎60 min，煎煮液按前“制附子单煎供试样品的制备”项下方法浓缩至120 ml，并同法操作，得供试样品。
       2.1.3  供试样品的测定与相关性分析
       供试样品含量测定:分别量取各供试样品2.0 ml，加纯水至3.0 ml，按前“测定波长选择”项下方法操作，于410 nm处测定吸收度，并计算生物碱含量。结果见表1～2。表1  煎煮时间对制附子中酯型生物碱含量的影响（略）表2  甘草配伍剂量对制附子中酯型生物碱含量的影响（略）
       相关性分析：分别以时间-生物碱含量（制附子∶甘草）配比-生物碱含量数据进行线性回归数据分析。结果见图1～2。
       由图1～2可见，随着煎煮时间延长和甘草剂量增加，附子中酯型生物总碱呈下降趋势，且酯型生物总碱含量与煎煮时间和甘草剂量有较高的相关性，r>0.9（图1，r=0.967 9；图2，r=0.973 8）。
       2.1.4   回收率实验取同一种附子单煎提取液，量取20.0 ml共5份，各加入浓度为0.680 mg/ml乌头碱标准品液1.0 ml，按前“制附子单煎供试样品的制备”项下同法操作制备回收率供试样品并同法测定含量，计算加样回收率。结果见表3。表3  附子中乌头碱类生物碱含量测定回收率实验（略）
       2.2  样品中乌头碱与次乌头碱含量的比较
       2.2.1  高效液相色谱条件色谱柱为gemini-C18-110A柱（250 mm×4.60 mm,5 μm),流动相为甲醇-水-氯仿-三乙胺(70∶30∶2∶0.1)，pH=8.90±0.1,检测波长为235 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为35℃。进样量10 μl。
       2.2.2  样品制备
       标准品溶液配制:取乌头碱、次乌头碱标准品，用10%甲醇溶解并定容为2 mg/ml的溶液，备用。
       供试品溶液制备:制附子原药供试品溶液按《中国药典》［1］（Ⅰ部）正文附子项下乌头碱限量检查供试品制备方法操作制备：取制附子粗粉20.0 g，置具塞锥形瓶中，加乙醚150 ml，振摇30 min，放置1～2 h，分取醚层，蒸干，用10%甲醇溶解并定容至2 ml，备用。另取制附子单煎30，60 min的药液100 ml（相当于100 g饮片），60℃浓缩至50 ml，用乙醚萃取4次，50 ml/次，分取醚层，蒸干用10%甲醇溶解并定容至2 ml，备用。
       2.2.3   样品测定按“2.2.1”项下色谱条件，样品各进样10μl，记录保留时间和峰面积。结果见表4。表4  供试样品与标准品溶液中乌头碱、次乌头碱含量（峰面积）比较（略）
       由表4可见，100 g制附子煎煮≥30 min，其煎煮液所含的乌头碱和次乌头碱含量低于2 mg/ml，也低于20 g制附子饮片原药的乌头碱和次乌头碱含量。
       3  结论
       以上研究表明，增加制附子煎煮时间或增加甘草的配伍剂量，可水解或除去具有毒副作用的乌头碱、次乌头碱等二萜类双酯型生物碱，降低毒性。酯型生物碱总含量的降低，与煎煮时间和甘草剂量有较高的相关性。由于酯型生物碱同时为药效成分，因此，在降低毒性保证安全的同时，应注意减少有效成分的损失，保证药效。本实验结果表明，100 g制附子煎煮≥30 min，其煎煮液所含的乌头碱和次乌头碱含量低于2 mg/ml，也低于20 g制附子饮片原药的乌头碱和次乌头碱含量（目前《中国药典》Ⅰ部正文中附子乌头碱限量检查中乌头碱对照品浓度为2 mg/ml，附子饮片检测取样量为20 g）。从临床用药的安全和有效角度考虑，在附子饮片质量符合《中国药典》质量检测规定的前提下，附子大剂量用药剂量不超过100 g时，建议煎煮时间为60 min，并可根据临床需要选择甘草配伍剂量。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005：132.
       
       ［2］罗国昌，张瑞贤.近20年附子超大剂量应用概况［J］.中国中药杂志，2005，30（2）：96.
       
       ［3］阴 健，郭力弓．中药现代研究与临床应用［M］.北京：学苑出版社，1994：382.
       
       ［4］丘小惠. 活性炭对乌头类生物碱的吸附作用［J］.广州中医药大学学报，1997，14（4）：268.