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       【摘要】 
       目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响，以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增（ISSR-PCR）最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素（Mg2+，dNTP，引物，Taq酶）在3个水平上进行优化实验，PCR结果用SPSS13.0统计软件分析，并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20 μl ISSR-PCR反应体系中，各组分的最适浓度为：2.0 mmol/L Mg2+，250 μmol/L dNTPs，0.50 μmol/L引物，1U Taq酶，40 ng DNA模板；模板DNA 40～90 ng，不同引物有不同的最佳退火温度，范围在48～52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。
       【关键词】  羌活 宽叶羌活 简单重复序列区间扩增 正交实验设计
       Optimization for ISSR-PCR Reaction System in Notopterygium incisum Ting and N. forbesii Boiss Using Orthogonal Design
       GU Song,  JIANG Shunyuan, TANG Xuefang, SUN Hui, YANG Zhirong,SUN Qun
       1.College of Life Sciences, Key Laboratory of Bio-resource and Ecological Environment of the Ministry of Education, Sichuan University, Chengdu 610065, China；
       2. Sichuan Institute of Chinese Materia Medica, Chengdu 610041, China；
       3. College of Architecture and Environment, Sichuan University, Chengdu 610065, China
       Abstract:Objective The optimal ISSR-PCR reaction system for Notopergium incisum Ting and N. forbesii Boissin was constructed by studying the influence of ISSR factors.MethodsThe orthogonal design with three levels of four factors (Taq DNA polymerase, Mg2+,dNTPs and primer) was used to optimize ISSRPCR amplification reaction system of N. incisum. and N. forbesii. The data of PCR results were analysed with SPSS software, and the different annealing temperatures were also studied by gradient PCR.ResultsThe optimal ISSR-PCR reaction system contained 2.0 mmol/L Mg2+, 1U Taq DNA polymerase，250μmol/L dNTPs, 0.50 μmol/L primer and 40 ng DNA template in the total volume of 20 μl. The Annealing temperature ranged from 48 to 52℃.ConclusionThe optimal ISSR-PCR reaction system provides the basis for further study on the genetic diversity among the populations of N. incisum. and N. forbesii.
       Key words:Notopterygium incisum;   N. forbesii;   ISSR-PCR;   Orthogonal design
       羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang和宽叶羌活N. forbesii Boissieu是我国特有的伞形科羌活属的多年生草本植物［1］，均为中药羌活的基源植物，以干燥根茎及根入药［2］，系传统中藏羌药的常用药材之一。主要分布在四川、青海、甘肃、西藏等省的高寒山区，历来依靠野生采挖。近年来的掠夺性采挖和生境破坏，致使各个道地产区面临资源枯竭和种质资源丧失的威胁，已被列入国家III级保护植物［3］，并进入中国濒危物种红色名录［4］。目前关于羌活在分子生物学方面的研究尚属空白。本次实验旨在建立一个适合于羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系，为下一步利用ISSR技术开展该类群的种质资源遗传多样性、遗传图谱构建和基因定位研究提供参考。ISSR（inter-simple sequence repeats , 简单重复序列区间扩增）是Zietkiewicz 等［5］1994年创建的新型分子标记技术，具有操作简单、成本低、快速灵敏、多态性高、所需DNA 量少以及无需预知研究对象的基因组序列等优点，同时也具有SSR的稳定性［6］。Jonsson等［7］的研究认为,在进行植物遗传多样性和系统发育的研究时,可优先考虑使用ISSR。国内近年来在药用植物方面也开始采用此方法。由于ISSR分子标记技术基于PCR反应，其同样也受多种反应因素的影响，不同物种对反应条件的要求也存在一定的差异，而且反应体系和程序不同也会产生不同的结果，因此，为了实现ISSR分析结果的可靠性和重复性，采用ISSR 分子标记技术时应首先对其反应体系进行筛选。正交实验设计具有均衡分散、综合可比及可伸缩、效应明确等特性，既减小了实验的规模，又不使信息损失的太多，克服了单因素实验顾此失彼、实验规模巨大的缺点，从而可以最快找到最优的水平组合［8］，本实验拟采用正交试验设计的方法，从Taq DNA 聚合酶、Mg2+，dNTP，Primer 4个因素各3水平对羌活ISSRPCR反应体系的条件进行筛选比较，并通过统计分析确立较为可靠的优化组合，在此基础上进行引物退火温度的梯度筛选。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       分别于20050917在四川省阿坝州壤塘县南木达乡和20060606在岗木达乡单株采集到羌活（J155）和宽叶羌活（J276）鲜嫩叶片，置硅胶中快速干燥，编号保存，并提取其DNA作为PCR扩增的模板。
       1.2   试剂与仪器
       ISSR引物采用加拿大大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia）提供的引物序列（set #9，NO. 801-900），经筛选以UBC 827，即(AC)8G作为此次正交实验的固定引物，由北京赛百胜基因技术有限公司合成；100 bp DNA Ladder购自Fermentas；DL2000购自清华天为时代；dNTP、TaqDNA聚合酶购自大连宝生物有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品，其它试剂为国产分析纯。
       PCR反应在美国MJ公司的PTC-200型PCR循环仪上进行。DNA浓度和纯度测定使用英国Biochrom 公司生产的GeneQuant Pro核酸检测仪。
       1.3   DNA的提取和测定
       参照邹喻萍等［9］ 改良CTAB稍加改动，提取其DNA，用核酸检测仪测定所提DNA的浓度和纯度，并在0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳检测其是否降解，然后稀释成30 ng/μl，备用。
       1.4   PCR反应体系的正交实验
       采用L9 (34 ) 正交实验设计［10］ ，结合预实验的结果，由Mg2+,dNTP,引物和Taq 酶4因素各3水平组成。见表1。 表1  ISSR-PCR正交实验设计表L9 (略)
       以上9个组合，每个处理2次重复，按表1加样。反应体系总体积为20 μl，引物为UBC 827 (AC)8G。除上述变化因素外，每管还包括1×PCR buffer，40 ng 模板DNA。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，循环35次；72 ℃延伸5 min；4℃保温，终止反应。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶于不超过5 V/cm 的电压下电泳，电极缓冲液为1 ×TAE或0.5×TBE，在含有0.5μg·ml-1EB中染色30 min，凝胶成像系统拍照记录和分析。结果用SPSS 13.0统计软件进行分析，得到ISSR-PCR反应各因素的最佳水平。
       1.5   退火温度的梯度筛选根据正交实验筛选出的最佳反应体系，对经初筛出的引物进行退火温度梯度筛选，根据理论退火温度，设定在46.0～60.0℃之间，扩增仪自动生成12个温度梯度：46.0，46.4，47.2，49.9，52.0，54.3，56.3，57.8，59.7，60.0℃，根据电泳结果筛选出各引物的最佳退火温度。
       2  结果与分析
       2.1  正交实验结果及分析
       2.1.1  正交实验结果的直观分析参照何正文等［11］的方法，根据L9 (34 ) 正交实验PCR产物电泳结果（图1），按本实验将要进行的遗传多样性分析的要求，将9个处理从高到低依次记分，分数越高，表示敏感性、特异性越好。羌活和宽叶羌活的两次重复均分别独立统计，依处理顺序得到的羌活样品的两次重复的分数分别记为：1，7，9，8，5，4，2，3，6；1，6，8，5，9，3，4，2，7。宽叶羌活样品的分数记为：2，5，9，7，6，3，4，1，8；1，7，9，4，8，3，5，2，6。
       2.1.2  正交实验设计结果的方差分析利用统计软件SPSS 13.0将上述独立记分结果进行方差分析［12］，结果见表2。由校正模型（Corrected Model）和截距（Intercept）的显著性检验结果可知，本实验数据使用一般线性模型进行统计（方差）分析是适合的，且具有较高拟合度。由F值可知，在本实验设置的因素水平范围内，引物的量对反应结果影响最大，dNTP的影响最小，各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为：引物，Taq酶，Mg2+，dNTP。Eta平方值显示，各因素对总变异的贡献顺序为：primer＞Mg2+＞Taq酶＞dNTP；4因素的观察效能均较高，表明其检验效能也高，无须增加样本量。表2   羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应各因素间方差分析 （略）
           
       统计分析结果（见表2）还显示出引物及Mg2+水平间差异达到极显著水平，Taq酶和dNTP水平间差异达到显著水平，进一步进行因素内多重比较。
       dNTP 作为PCR 反应原料，量太少会使扩增反应进行不完全；量过多，则会对Mg2+产生拮抗作用，且造成不必要的浪费。多重比较显示（图2 b）本实验所选梯度范围dNTP对PCR反应结果均值随其浓度增加呈缓慢上升趋势，以2.50 μmol·L-1最佳。
       Mg2+主要是通过改变聚合酶的活性对PCR 反应结果产生影响，本实验各浓度水平对结果的影响有一定差异，表现为1.5～2.0 mmol·L-1范围内，反应结果均值随Mg2+浓度平均值递增，但差异不显著，二者与2.5 mmol·L-1水平间差异显著（图2 a），本文确定Mg2+浓度为2.0 mmol·L-1。
       引物浓度的0.25，0.50 μmol·L-1和0.75 μmol·L-1水平间差异显著，说明引物浓度水平变化对PCR产物电泳是影响ISSR扩增的一个重要因素，引物浓度过高易引起碱基错配和产生非特异性扩增，还易形成引物二聚体；引物浓度过低，其与DNA 模板结合位点少，扩增产量下降，且扩增结果不稳定（如图1中1，6，8号处理所示）。本实验中引物浓度定为0.50 μmol·L-1，将此浓度用于不同引物的扩增均获得良好效果（图2 c）。
       Taq酶对PCR反应的影响在所选梯度范围呈正相关，即随着Taq酶量增加，结果均值呈上升趋势（图2 d），但对本实验结果的影响相对较小。根据对羌活和宽叶羌活样品数据分别分析，并结合对Taq酶单独进行梯度实验验证，1.0 U表现最为稳定，故在20 μl体系里选择1.0 U为最佳反应水平。
       2.2  不同退火温度对ISSR-PCR扩增的影响
       PCR反应中，退火温度直接影响引物与模板的特异性结合［13］，根据正交实验设计的结果,选择2号处理进行退火温度的梯度筛选实验，在MJ Research PTC-200扩增仪上自动生成12个温度，进行温度梯度比较，结果（见图3）表明，退火温度过低则扩增特异性差，背景深；退火温度过高，则引物与模板结合差，PCR产物丰度低，电泳条带亮度小。并且引物不同，其所需的最适退火温度区间也有差异。对其它引物进行梯度PCR扩增亦得到了相似结果，由于ISSR引物较长，可相对提高ISSR反应的退火温度，以提高反应的准确性和稳定性。图3显示，UBC835的适宜退火温度是48℃，而UBC864的最适退火温度为52℃左右。
       3  讨论
       由于ISSR分子标记技术基于PCR反应，其扩增谱带虽较RAPD标记稳定，但同样受反应条件和扩增程序变化以及物种不同的影响［9］。有的研究认为Taq酶的浓度变化影响最大［12］，有的认为PCR对Mg2+最为敏感［14］，有的研究结果显示dNTP影响最大［15］，可能由于实验材料的不同及反应各因素的综合作用等原因导致本实验结论有所不同。
       正交实验法用于PCR反应条件优化已见诸报道［11，12，14，15］，虽然实验结果的定量判断依据带有一定主观性和个体差异，不能很好地估计实验误差等局限性，但此法能通过较少量的实验，较快找到影响反应条件的主要因素的较为优化的水平组合，避免了单一因素实验结果的不足，不失为一种快捷、高效的实验筛选方法。本实验同时对羌活属两种植物样品开展正交筛选，优化组合结果显示出较高的一致性，结合单因素实验验证确定了最优组合，将为下一步开展羌活遗传多样性等研究打下了良好的基础。
       4  结论
       本实验利用正交实验设计方法，初步建立并优化了羌活和宽叶羌活ISSR 标记的PCR 反应体系。这一反应体系受诸多因素的影响，包括Mg2+浓度，dNTPs，引物，Taq 酶、和DNA 模板等各反应成分都会影响PCR 产物的生成和质量。采用两种分析方法对4因素（Mg2+，dNTPs，引物，Taq 酶）3水平的正交实验结果进行分析比较，得到相似结果，均显示在本实验所设置的因素水平范围内，引物浓度对PCR实验结果影响最大，且不同水平间差异极显著，而dNTPs影响较小。
       本实验研究还表明，对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR的扩增中，退火温度明显影响扩增带的式样，不同引物的最佳退火温度不同。综合比较得到在20 μl ISSR-PCR反应体系中，各组分的最适浓度为：2.0 mmol/L Mg2+，250 μmol/L dNTPs，0.50 μmol/L引物，1U Taq酶，40 ng DNA模板；不同引物采用不同的退火温度，大致在48～52℃。
       【参考文献】
         　　［1］溥发鼎, 王萍莉, 郑中华, 等. 重订羌活属的分类［J］.植物分类学报, 2000, 38(5): 430.
       
       ［2］国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部 ［S］. 北京: 化学工业出版社, 2005：127.
       
       ［3］孙辉, 蒋舜媛, 周 毅, 等. 药用植物羌活现状及其民族植物学调查［J］.世界科技研究与发展, 2004, 26(6): 42.
       
       ［4］汪松, 解焱. 中国物种红色名录. 第一卷［M］.北京：高等教育出版社，2004：8507.
       
       ［5］Zietkiewicz E., Rafalski A , Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics, 1994, 20:176.
       
       ［6］何予卿, 张 宇, 孙 海,等. 利用ISSR 标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系［J］.农业生物技术学报, 2001, 9(2)：123.
       
       ［7］Jonsson B. O. Jonsdottir I. S., Cronberg N. Clonal diversity and allozyme variation in population of the arctic. Carex bigelowii［J］.J. Ecol, 1996, 84: 449.
       
       ［8］余艳, 陈海山, 葛学军. 简单重复序列区间（ISSR）引物反应条件优化与筛选［J］.热带亚热带植物学报, 2003, 11(1): 15.
       
       ［9］邹喻萍,葛 颂,王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：北京科技出版社, 2001: 16.
       
       ［10］杜荣骞. 生物统计学［M］.北京: 高等教育出版社. 1985：479.
       
       ［11］何正文,刘运生,陈立华,等. 正交设计直观分析法优化PCR条件［J］.湖南医科大学学报, 1998, 23 (4): 403.
       
       ［12］谢运海, 夏德安, 姜 静, 等. 利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系［J］.分子植物育种, 2005, 3(3): 445.
       
       ［13］卢圣栋. 现代分子生物学实验技术(第二版)［M］.北京：中国协和医科大学出版社, 1999：458.
       
       ［14］王彦华, 候喜林, 徐明宇. 正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究［J］. 西北植物学报, 2004,24(5): 899
       
       ［15］穆立蔷, 刘赢男, 冯富娟, 等. 紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化［J］.林业科学, 2006, 42(6): 26.