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       【摘要】 
       目的为阐明阴阳失衡对肿瘤生长的影响。方法采用甲状腺素和利血平、氢化可的松分别制作阴虚、阳虚模型,并接种S180瘤株；用RT-PCR的方法分析肿瘤细胞基因表达的水平。结果阴虚组的瘤重均高于正常和阳虚组, 而差异不明显（P>0.05），但影响肿瘤增殖的PCNA基因表达水平明显高于正常和阳虚组(P<0.05)。结论阴虚体质可加速肿瘤的生长，其机理可能是增加肿瘤细胞中的PCNA基因的表达。
       【关键词】  阴阳虚荷瘤小鼠 瘤重 基因表达
       Effect of Yin Deficient in Tumor Cell Proliferation of Tumor Bearing Mice
       ZHENG Lixiang, ZHANG Yuren, ZHU Weifeng, LIU Hongning
       Jiangxi University of TCM,  Nanchang ,330004, China
       Abstract：ObjectiveTo elucidate the influence of "Yin" and "Yang" imbalance  on tumor occurrence .MethodsThyroxine within reserpine, hydrocortisone were used to produce "Yin" and "Yang" deficient model respectively . Then the model mice were transplanted S180 tumor cells. The level of genes expression was analyzed by PT-PCR. ResultsThe "Yin" deficient group’s tumor weight was more than the normal group" s and "Yang" deficient group’s ,but the difference was not significant (P>0.05). Its PCNA gene expression level that affected tumor proliferation was significantly higher,compared with the normal group and "Yang" deficient group (P<0.05).Conclusion"Yin" deficient physique can accelerate tumor growth, the mechanism maybe that it  increases the PCNA gene expression in tumor cells.
       Key words：Tumor bearing mice in "Yin" and "Yang" deficient;  Tumor weight;  Gene expression
       
       恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病和多发病，现代医学认为恶性肿瘤主要是由于细胞的增殖、分化、衰老、死亡等方面行为的异常和失衡所致肿瘤细胞的克隆性生长造成的，是全身性疾病在局部的表现［1，2］。而中医认为，肿瘤的形成多因人体阴阳失衡,恶性肿瘤虽然生长在人体的某个部位，其实肿瘤是全身疾病的局部表现，是人体阴阳严重失衡的结果［3～6］。为进一步认识阴阳失衡对肿瘤生长的影响，笔者将在阴虚、阳虚动物模型上接种S180瘤株，观测这两种体质情况下肿瘤的生长情况，并对瘤块中影响肿瘤生长的增殖细胞核抗原(PCNA)、拓朴异构酶Ⅱa(TOPⅡa)、DNA聚合酶a(DNApola)的表达产物进行分析，为中医药防治肿瘤提供实验依据。现报道如下。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       实验小鼠由江西中医学院动物中心提供的清洁级昆明小鼠，重约18～22 g；S180瘤株由上海生物所提供；氢化可的松注射液(100 mg／支) 苏卫药准字(1982)第241701号，批号：20010302，扬州制药厂生产; 甲状腺素，批号：0607501。利血平，SIMGA公司，批号：2000497。仪器：低温高速离心机，BECKMEN；PCR扩增仪Gene Amp PCR system 9700(ABI)、凝胶成像系统Fluorchem 9900(Alphainnotech)；试剂：TRIZOL试剂盒购自上海生物工程技术公司; M-MLV Reverse Transcription KIT 购自上海晶美生物技术公司;  MIX：上海晶美公司；其余的试剂均为分析纯
       1.2  方法
       1.2.1  动物模型的制备阴、阳虚模型参阅郑里翔［7］，造模后根据阳虚症状的客观指标：怕冷、畏寒喜暖、四肢不温或厥逆、小便清长、脉细、舌淡胖、倦缩拱背、精神萎顿、消瘦等确定模型成功与否;而阴虚组症状给药第1～2天无明显变化。第3～4天开始出现躁动不安、皮毛汗湿尤以夜间为甚，大便或干或湿，饮食量无明显改变，第5天肛门红,24 h饮水量增加。第6～7天起出现日间神疲少动，体重减轻,清瘦,确定模型成功。
       1.2.2  肿瘤模型建立于超净工作台中，先取S180肉瘤瘤液0．1ml，以生理盐水20倍稀释，光学显微镜下计算1 ml瘤液中活体瘤细胞数，以此计算瘤液的稀释倍数，用生理盐水稀释成2×106 个／0．2ml。置于冰中保存，75％ 酒精消毒小鼠右腋皮肤，按每鼠0．2ml接种于小鼠右腋皮下, 10日处死小鼠并称体重，严格按标准剥离干净皮下肿瘤组织，使用电子秤称量瘤重(精确到0．01g)，并迅速放到液氮中。
       1.2.3  Trizol试剂提取总RNA提取冷冻组织(约0．1 g)剪碎后加入液氮后碾成粉末，加1ml Trizol，彻底混匀。加0．3 mI氯仿，用力摇匀后离心。取上清，加1 mI异丙醇沉淀水相中的RNA，得到的RNA经75％乙醇漂洗后溶解于DEPC水中。用紫外分光光度仪测总RNA的纯度及浓度(波长260／280 nm)。
        RT—PCR的方法：首先逆转录cDNA，进行PCR扩增，PCR反应混合物总体积50 ul。PCR 引物、反应条件（见表1）。PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下摄像，以β-actin为内参，用凝胶成像分析系统进行半定量分析。表1  引物、产物大小及条件（略）
       1.3  统计学方法各数据均以±s表示，，应用SPSS11.5统计分析软件处理实验数据,组间用t检验。
       2  结果
       2.1  接种瘤株的第10天,称老鼠重量,处死,剥离瘤块,称取瘤重从表2的结果来看，3组之间老鼠的重量，无论在接种瘤株时，还是取瘤块时，阴虚组、阳虚组小鼠的体重均比正常组轻（P ＜0.05），而瘤重3组之间并没有明显差异（P>0.05）,但阴虚组的瘤重要高于其余两组，提示：阴虚体质情况下，更有利于肿瘤的生长。表2  造模型前后及取瘤块前后小鼠重量(略)表3  阴虚、阳虚小鼠接种S180第 10天各组瘤重（略）
       2.2  瘤块中PCNA、TOPIIa、DNApola的表达产物剥离出瘤块后，迅速放入液氮中保存，再用TRIZOL提取总RNA，经逆转录后的产物,经1%的琼脂糖凝胶电泳，半定量分析3个基因表达的产物（图1，表3）。从结果来看，PCNA有明显的差异（P<0.05）,而TOPIIa、DNApola则差异不明显(P>0.05)，由于PCNA可直接可参与促肿瘤的生长的过程，提示：阴虚组肿瘤的生长过快，可能与PCNA的过量表达有关。表3  不同体质下对肿瘤PCNA、TOPIIa、DNApola基因表达的影响（略）
       3  讨论
       中医理论认为，疾病发生发展的根本原因在于机体的阴阳失调，恶性肿瘤亦不例外。恶性肿瘤的发生是由于机体阴阳失衡，正气渐虚，外邪乘虚而入，气化不利，导致气结、痰凝、血淤、热毒搏结日久积滞而成。正如《诸病源候论·积聚候》日：“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受之风邪，搏于脏腑之气所为也。’将积聚的产生归于阴阳不和。恶性肿瘤是一种全身性疾病，乃全身属虚、局部属实的病变，其特点在于因虚致实，又因实致虚，病因病理复杂，变化多端。归根结底,还是阴阳失衡所导致［8，9］。
       从实验结果（见表2）来看，无论是阴虚、还是阳虚，肿瘤的生长均要高于正常组，这进一步说明了在阴阳失衡的情况下,会加速肿瘤的生长，但阴虚肿瘤的生长更快。这是因为人体之阴应分为阴津、阴液、阴精三大部分，阴津以水液为主，对人体主要起滋润作用；阴液含有较多营养成分，主要起濡养作用；阴精为属阴的精华物质，主要起养生(即促生长、防退化)的作用，阴虚导致的机体精、血、津液等物质亏耗，容易受到外邪侵犯［5］，从而加速了肿瘤的快速生长。
       肿瘤的发生、发展是多基因突变，多环节失控的结果，细胞周期调控失衡是其中的重要机制之一。许多癌基因、抑癌基因直接参与细胞周期调控，或者本身就是细胞周期调控复合体的主要成分［1，2］。
       PCNA 、TopoⅡa 、DNApola均位于细胞核内的物质，它们对DNA解链、DNA 复制后断端连接和复位起关键作用，是真核细胞生存不可缺少的细胞核内的物质。从上述的实验结果来看，阴虚组瘤块中PCNA的基因表达水平要明显高于正常组和阳虚组（P＜0.05），说明阴虚组肿瘤的生长加快与PCNA有密切相关，这是因为PCNA的表达和合成与细胞的增殖周期相关，其表达程度反映了细胞的增殖状态，其过度表达导致细胞增殖失控，是肿瘤恶性程度的重要指标［10］。
       从上述结果看，在阴阳失衡的情况下，均可加快肿瘤的生长，但阴虚组肿瘤的生长速度要比阳虚组、正常组快，可能的机制是PCNA的过度表达导致肿瘤的生长过快。由于中医学的特点是以”人”为本的整体观点，以调整阴阳的辨证施治为其核心，在防范肿瘤的发生发展，与癌共处，带瘤生存，传统中医学则有其广阔用武之地，且有可能跃居主角之位。《黄帝内经索问·生气通天论》指出：“ 阴平阳秘， 精神乃治， 阴阳离决， 精气乃绝 ”,益气养阴、滋阴等法都是调整阴阳的具体体现［11］，故上述的实验结果为益气养阴、滋阴等临床辨证施治肿瘤提供了实验支持。
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