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       【摘要】 
       目的通过筛选一株高产β葡萄糖苷酶菌株对栀子进行发酵，使得其中的京尼平苷转化为京尼平。方法通过底物特异显色筛选模型筛选菌株，并使用正交实验对发酵条件进行优化。结果筛选到一株产β葡萄糖苷酶酶活可达到8.2 u/ml的青霉Penicillium nigricans，并优化了发酵转化条件，使得京尼平苷的转化率可达到95%以上。利用波谱法对发酵产物进行了结构鉴定，证明转化产物为京尼平。结论 通过微生物转化的方法可以使栀子中主要成分京尼平苷转化成具直接作用的有效成分京尼平。
       【关键词】  栀子 京尼平苷 青霉 京尼平 微生物转化
       Studies on the Microbial Transformation of Geniposide in Gordenia
       WANG Yonghong, SU Jian, WANG Jianfang, LIAO Yong, FENG Bin, SUN Qiling
       (College of Life Sciences, Key Laboratory of Bio-resources and Ministry of Education,Sichuan University, Chengdu 610064, China)
       Abstract:ObjectiveGardenia (Gardenia jasminoides Ellis) was subjected to fermentation process by βglucosidase strain to transform geniposide into genipin, a more effective compound. MethodsThe model of specific colorizing was used to screen the strain. The conditions of fermentation process were optimized by an orthogonal layout. ResultsThrough the model of specific colorizing, the strain with high ability of microbial transformation has been screened. The transformation rate could reach to 95%. It was proved that the products was genipin.ConclusionGeniposide which was the effective compound of gardenia can be transformed into genipin by the method of microbial transformation.
       Key words:Gardenia jasminoides;  Geniposide;  Penicillium nigricans；  Genipin;   Microbial transformation
       栀子是茜草科（Rubiaceae）栀子属（Gardenia）植物，入药部分为其干燥成熟果实，性味苦寒，归心、肺、三焦经。主要具有保肝利胆之功效，药效成分是以京尼平苷为代表的环烯醚萜苷类，此外还含有有机酸类、色素类、挥发油等成分［1］。
       药代动力学研究发现，栀子有效成分京尼平苷的利胆作用是通过肠道微生物产生的β葡萄糖苷酶水解所生成的京尼平而引起的［1］。日本Mie Inao等对栀子治疗肝硬化的研究表明，京尼平苷的水解产物京尼平能够抑制肝脏星状细胞的活性而达到对肝硬化疾病的治疗［2］。同时，已有研究证明京尼平亦具有显著抗炎、抗脂质过氧化、抗血管生成、抗NO生成［3］、抗淀粉β蛋白质的神经毒性等药效［4］， 京尼平也是迄今为止所研究的环烯醚萜物质中抑制诱变剂诱变活性最强的物质［1］。京尼平还可被应用于生物材料的交联，它不仅能形成稳定的交联制品，同时具有细胞毒性小，生物相容性好，抗降解能力强和应用领域广泛等优点，是非常有前途的生物交联剂。京尼平在栀子中的含量很低，约为0.005%～0.01%，主要是以其前体形式京尼平苷形式存在，含量约为3%～5%。因此，利用微生物与中药栀子共发酵生产京尼平具有非常重要的意义。
       微生物转化栀子的原理即利用β葡萄糖苷酶的产生菌与栀子进行共发酵，在β葡萄糖苷酶的作用下，使京尼平苷的糖苷键断裂而生成京尼平。
       本文利用一株产β葡萄糖苷酶的青霉Penicillium nigricans与栀子共发酵，确立了发酵最优条件，进行了发酵动力学的研究，阐明了发酵过程中酶活变化与京尼平苷转化的关系，分离纯化了产物，并对产物进行了性质和结构鉴定。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       菌种为本实验室从自然界分离得到，经鉴定为一株黑青霉Penicillium nigricans，编号为MK-1。
       栀子果实购于成都同仁堂药店。京尼平购自安徽DELTA天然有机化合物信息中心。薄层色谱预制板硅胶G（福山生化试剂厂），其余试剂均为市售分析纯。
       GBRT全自控10L发酵罐(烟台高新区海洋生物工程研究所)，HQ45型恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限责任公司），Shimadzu LC10AT高效液相色谱仪，Tu1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Bio TOF ⅢQ型质谱仪，Bruker Avance 600型核磁共振仪，XT4显微熔点测定仪，BioRad，FTS175傅立叶红外分光光度计（美国伯乐公司产品）。
       1.2  方法
       1.2.1  菌种筛选以及鉴定方法初筛条件的确立：以1%的栀子煮提液做酶反应底物，配以土豆培养基配方形成初筛培养基，加入琼脂粉配制初筛平板，将待测菌株接入，25℃培养2 d后，观察菌落周围的显色圈大小以确定京尼平苷转化活性［5］。
       菌种复筛：将初筛菌株接入土豆发酵培养基，发酵4 d后，离心得粗酶液，分别以5%的栀子煮提液为酶反应底物，0.1 mol/L的甘氨酸为显色底物，加入琼脂粉配制复筛平板，点孔后，准确加入适当浓度的粗酶液5 μl，40℃保温5 h，观察显色圈。显色圈大小可反应转化率高低。
       通过菌落、菌丝体、孢子梗形态以及菌种的生理生化特征对筛选到的菌种进行了鉴定。
       1.2.2   TLC法分析 
       采用硅胶G（20 cm×10 cm）薄层色谱板，展开剂为醋酸乙酯：石油醚（1∶1），显色剂为用0.1mol/L，pH7.0的磷酸缓冲液配制成的0.44 mmol的甘氨酸溶液。
       1.2.3  京尼平苷与京尼平的HPLC检测方法［6］色谱柱为Columns C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱温为25℃；流动相为甲醇－水（45∶55）；流速1ml/min；检测波长238 nm；进样量10 μl。
       京尼平苷标准曲线的制作：精密称取京尼平苷1.00 mg，置于1.5 ml的EP管中，加甲醇∶水（1∶1）溶解，精确吸取20，40，60，80，100 μl的对照品溶液到1.5 ml的EP管中并用甲醇∶水（1∶1）溶液稀释至100 μl，然后吸取20 μl进行测定。以峰高(Y)对含量（X）作回归计算。结果表明，在0.2～1 mg/ml范围内，京尼平苷有良好的线性关系，回归方程为Y＝2 208.6X－41.419，r=0.999 9。
       京尼平标准曲线的制作方法同上，以峰高(Y)对含量（X）作回归计算，结果表明，在0.2～1 mg/ml范围内，京尼平有良好的线性关系，回归方程为Y＝2478.4X+14.149，r=0.999 4。
       1.2.4  发酵条件的确立以栀子果粉为培养基成分，将其调配成栀子粉液态培养基，pH自然，121℃灭菌25 min。将筛选到的青霉MK-1以孢子形式接入液态发酵培养基中，混合均匀后于恒温振荡器中培养。发酵条件的确立采用正交实验方法。
       
       考察栀子果粉浓度、发酵温度、发酵时间、转速以及装液量5个因素来设计正交实验表，确定最优的发酵条件。
       1.2.5   京尼平的结构鉴定 
       将发酵产物提纯后经过显微熔点测定仪对其进行了熔点测定，以及通过紫外、质谱、红外、核磁共振对其结构进行鉴定。
       2  结果
       2.1  栀子高转化活性菌株的确立通过底物特异显色筛选模型，其在平板上的显色圈越大的菌落转化活性越高。根据这个原则，筛选出一株具有高转化活性的菌种编号MK1。
       通过京尼平苷酶活测定法测得β葡萄糖苷酶酶活可达到8.2 u/ml。
       2.2  发酵条件的确立正交实验对发酵条件的优化，其结果见表1。表1  发酵条件优化正交实验设计及结果分析（略）
       通过正交实验得到的栀子发酵最佳条件为：栀子果粉浓度为10%，温度为30℃，培养时间为108 h，转速为180 r/min，装量为15%。
       
       本研究中所采用的发酵技术，不仅使京尼平苷充分溶出，而且使其转化率达到95%以上。另外，由于栀子果粉中含有丰富的营养成分，因此发酵不需要添加其他营养物质，大量节约了生产成本，更适合工业化生产。
       2.3   产物的结构鉴定结果分析将产物提纯后经过显微熔点测定仪对其进行了熔点测定，以及通过紫外、质谱、红外、核磁共振对其结构进行了鉴定，具体数据如下：Mp, 118-120℃.UV (CH3OH) ìmax 238.EIMS, m/z 227.IRυmax：1007，1105，1686，2849，2929，2935,3030,3238,3386cm-1.1H NMR (CDCl3)δ：7.53(s, H-3), 5.89 (s, H-7), 4.82 (d, J = 8.5 Hz, H-1), 4.35 (d, J =13.2 Hz, H-10), 4.29 (d, J =13.2 Hz, H-10), 3.74 (s, -OCH3), 3.22 (ddd, J =9.5, 8.5, 8.5 Hz, H-5), 2.89 (ddt, J =16.8, 8.5, 1.4 Hz, H-6), 2.54 (ddd, J =8.5, 8.5, 1.5 Hz, H-9), 2.07 (ddt, J=16.8, 9.5,1.8 Hz, H-6)。与文献［7］报道一致，确定其为京尼平。
       3  结论
       随着中药现代化的发展，利用微生物进行中药发酵有望成为中药使用领域的一大有力工具。微生物能产生丰富的酶系，具有非常强大的分解转化物质的能力, 通过微生物的生长代谢和生命活动来转化中药, 可以比一般的物理或化学手段更大幅度地改变药性, 提高疗效。由于真菌在微生物中具有种类多、次生代谢产物多、培养条件比较简单等特点, 因此是发酵中药的主要功能菌。这也是微生物可以用来发酵转化中药的理论根据［8，9］。
       通过底物特异显色筛选模型，对转化栀子的β-葡萄糖苷酶产生菌进行筛选，具有特异性高、快速简便的优点，相比其它的菌种筛选方法有不可比拟的优势。微生物转化栀子中主要有效成分京尼平苷为京尼平比传统的酶解法具有成本低，更适合工业化生产的优点。
       通过分离纯化即可得到纯度很高的京尼平，可应用于医学、生物材料等领域。
       【参考文献】
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       ［3］Hye-Jin Koo，Yun Seon Song，Hee-Jeong Kim，et al. Antiinflammatory effects of genipin, an active principle of gardenia ［J］. Eur J Pharmacol，2004，495：201.
       
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       ［5］Paik Young-Sook, Lee Chang-Min, Cho Man-Ho, et al. Physical Stability of the Blue Pigments Formed from Geniposide of Gardenia Fruits: Effects of pH, Temperature, and Light ［J］. J. Agric. Food Chem，2001, 49, 430.
       
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