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       【关键词】  佛手；,,香橼；,,rDNA,ITS序列
       摘要：目的分析广佛手及其近缘种香橼的rDNA ITS序列及其规律。方法采用PCR直接测序技术测定广佛手和香橼rDNA ITS序列并作序列变异分析。结果4个植物样品rDNA ITS序列长度为644~672 bp。其中5.8S rDNA 长度为165 bp，编码区较保守。广佛手和香橼的ITS1和ITS2序列平均遗传距离分别为0.009 5和0.014 2。结论rDNA ITS序列可为鉴定佛手提供分子参照系统。
       关键词：佛手；  香橼；  rDNA ITS序列
       Preliminary Study on rDNA ITS Sequencing and Characteristics of Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle
       GAO Xiaoxia, CHEN Xiaoying, LUO Yuansheng
       (Guangdong University of Pharmacy, Guangzhou510006,China;Guangdong Guang-Hong Medicine ＆  Drug Company Limited,Guangzhou510089,China)
       Abstract:ObjectiveThe ribosomal DNA internao transcribed spacers(ITS)and 5.8S rDNA ITS sequence of Citrus medica L.var.sarcodactylis(Nootc).Swingle and C.medicaL. were sequenced.MethodsThe rDNA ITS gene fragment was amplified by PCR with universal primers of rDNA ITS and sequenced.ResultsThe DNA sequence of ITS ranged from 644 bp to 672 bp and the   5.8S gene of all of the samples was 165 bp in size.Distance values of ITS1 and ITS2 sequence,estimated according to Kimura two-parameter models between Citrus medicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle and its adulterant and C.medica L.,were 0.0095 and 0.0142,respectively.ConclusionrDNA ITS sequence may be the evidence for the molecular authentication of Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle.
       Key words:Citrus medica L.var.sarcodactyis(Noot.) Swingle;  C.medica L.;  rDNA internal transcribed spacers sequence
   
　　DNA 分子标记技术进入到中药材鉴定和品质评价等研究领域，提供了大量的潜在特征，在中药材近缘属间，属内以及种内居群间的差异性研究［1］中得到了广泛应用。作为18S～26S rDNA 组成部分，rDNA 中的内转录间隔区（internal transcribed spacer ,ITS）序列是中度保守的重复序列，在被子植物较低的分类阶元上具长度保守性和核苷酸序列的高度变异性［2］，这使得这些间隔区的序列可以用rDNA基因的通用引物实现快速扩增、容易排序，而高度变异性可以提供丰富的变异位点和信息位点，在许多被子植物发育和进化研究中已证明是十分有用的分子标记［3～5］。佛手是芸香科柑橘属植物Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.) Swingle成熟果实［6］。其性味辛、苦、酸、温，具有理气健胃、镇呕祛痰之功，治疗胸腹胀满、消化不良、咳嗽、痞满等症，为我国传统中药。佛手醇提物对大鼠、兔离体肠管有明显解痉作用；能显著增加豚鼠离体心脏的冠脉流量和提高小鼠的耐缺氧能力［7］。广佛手主产于广东德庆、高要、云浮、郁南、化州等地，栽培历史悠久，为广东地道药材“十大广药”。在商品流通领域同属植物香橼C.medica L.［8］也混作佛手使用，其品质呈现较大差异。为充分利用佛手这一地道药材资源，更好地控制其质量，本文测定了广佛手及其近缘种香橼的rDNA ITS序列。通过探讨上述品种间的DNA序列变异关系及其规律，为佛手基原植物的准确鉴定提供分子依据。
       　　1  材料和方法
       1.1  材料来自广州市的新鲜植物材料由广州省中药研究所华南中药种质资源库提供；来自广东化州地区的新鲜植物材料由本文第三作者采集，并由广东药学院中药鉴定教研室鉴定。见表1。
       表1  广佛手和香橼rDNA ITS序列特征及在EMBL的注册登记号（略）
       1.2  试剂CTAB（gene）,ExTag DNA聚合酶（Mg2+，15 mmol/L）（TaKaRa），琼脂糖（Promega）,PCR产物纯化试剂盒（QIAGEN），10 mM dNTP(Sangon)。
       1.3  主要仪器台式高速离心机（Sigma），涡旋混合仪（IKA WORKS），PE480 PCR扩增仪（PE），恒压恒流电泳仪（Life Technologies ），凝胶成像仪（Kodak EDAS120），全自动测序仪（Perkin Elmer377）。
       1.4  总DNA的提取和纯化新鲜植物叶片，参照Rodrigues组织培养表面消毒的［9］方法处理后各0.1 g，加液氮研磨成细粉后，使用改良的CTAB法提取总DNA［10］，于-20℃保存备用。
       1.5  目的基因片断的PCR扩增、产物纯化和测序为了保证测序的准确性，本文设计了3套引物，包括扩增rDNA ITS全长（18Sp48,26Se37）、ITS1（18Sp48,5Sp15r）和ITS2（5Sf31,26Se37）的引物。上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。18Sp48：5"AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3";26Se37：5"TTCTCCGCTTATTGATATGC3";5Sp15r：5"GATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTG3";5Sf31：5"GCATCGATGAAGAACGCAGC3";PCR分别扩增上述3个目的片断，20 μl反应体系中含10×Buffer 2 μl 10 mmol/L dNTP 0.5 μl，25 mmol/L Mg2+2.4 μl,10 μmmol/L正向引物和逆向引物各1 μl，DMSO 1 μl，ExTaq(5U/μl)0.1 μl，DNA模板（适宜浓度）2 μl，灭菌三蒸水（3 d H2O）10 μl。PCR扩增条件为94℃变性4 min，94℃1 min，50℃2 min，72℃2 min，循环30次；70℃延伸10 min，以3 dH2O代替模板DNA作空白对照。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。PCR产物经QIAquick PCR纯化试剂合纯化后，由英骏广州测序实验室（英骏生物技术有限公司）测序。为保证测序的准确性，PCR扩增获得的3个目的片断分别采用正向和反向测序，用MegAlign程序进行序列的拼接。
       1.6  序列分析所得序列用CLUSTAL X（Version 1.8）进行多重比对［11］，编辑和校正多重比对结果用BioEdit(Version 5.0.9)［12］;ITS1和ITS2的位置参照其二级结构,EMBL和GenBank上的参考序列。采用PAUP4.0（版本4.0b8）程序［13］，使用Kimura two-parameter（K2P）［14］模型构建序列距离矩阵，将序列鉴定结果与形态鉴定结果核对，确认后在EMBL登记注册，其注册登记号见表1。
       　　2  结果
       本研究共测得广佛手和香橼的片段包括ITS1，5.8S和ITS2全长序列以及18S，26S部分序列，长度为676～700 bp。根据芸香科植物Murraya paniculata已报道的序列资料（GenBank AJ879085）确定rDNA内转录间隔区ITS1和ITS2与3个编码区18S，5.8S和26S的界限。从图1中可见，5.8S全长为165 bp，编码区序列相对保守，其中广佛手有1个碱基的缺失和3个碱基的变异。ITS1和ITS2长度以及GC含量详见表1和图1。两者ITS1的长度分别为227 bp和257 bp，其中佛手有29个碱基的缺失，GC含量差异较大（60.3%～64.3%）；ITS2的长度分别为250 bp和253 bp，其中香橼有5个碱基的缺失，GC含量差异小（67.9%～69.9%）。
       “*”表示碱基缺失，“-”表示与佛手碱基相同
       图1  广佛手和香橼rDNA ITS序列比对结果（略）
       广佛手和香橼的ITS1和序列ITS2序列分别用K2P参数遗传距离模型计算序列间遗传距离。二者ITS1和ITS2序列间平均遗传距离分别为0.009 5，0.014 2。来自广州和化州的佛手种内ITS2序列遗传距离为0.008 0 。
       　　3  讨论
       本文通过对不同产地的广佛手和香橼新鲜植物叶片总DNA的提取，利用真核生物通用引物扩增rDNA ITS区序列，分析上述品种间rDNA 序列变异关系及其规律，为广佛手的准确鉴定提供分子依据。由于佛手和香橼含有较多的植物多糖成分，在DNA提取过程中存在一定的困难，本研究应用改良的CTAB法，可以从新鲜植物叶片中提取到较高质量的总DNA。马伯军等［15］在建立产于金华地区的红花、白花青皮、白花白皮佛手RAPD扩增系统的研究中应用十二烷基磺酸钠（SDS）溶液提取基因组DNA，也获得较好的效果。由于广佛手和香橼rDNA ITS序列中GC含量在60%以上，这对PCR产物直接测序结果的准确性造成一定的影响。本研究中设计的二对引物，可以分别扩增ITS1和ITS2目的片断，获得rDNA ITS序列的全部信息，从而更利于今后的实际应用。广佛手和香橼rDNA ITS区序列在种内的差异非常小（＜1%），不同产地的广佛手间仅有1个变异点，反映了种内的遗传稳定性，其微小的差异可能是由于测序反应中的碱基的错配或种内遗传的多态性所致。广佛手作为香橼种下的一个变种，二者的rDNA ITS序列的总长度为645 bp，香椽rDNA ITS序列的总长度为672 bp。其中佛手5.8S rDNA有4个位点的变异，ITS1区有大段的碱基缺失；香橼的ITS2区也有5个碱基的缺失。本文分析的柑橘属2个近缘物种ITS1区变异分布明显大于ITS2区，这与大多数被子植物相同。rDNA ITS序列在柑橘属间分化活跃，信息含量丰富，是较为理想的分子标记指标，为利用rDNA ITS序列进行佛手药材鉴定奠定了基础。
       　　参考文献：
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       (广东药学院，广东 广州  510006；  广东广弘药材有限公司，广东 广州  510089)