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       【关键词】  山药；,,ITS区序列；,,聚合酶链反应
       摘要：目的分析怀山药与其它产地山药的rDNA ITS区序列的差异，为山药的基源鉴定和品质评价提供分子依据。方法采用PCR扩增纯化后直接测序的方法测定不同产地山药的rDNA 基因ITS核苷酸序列并作序列同源性分析。结果8种产地山药的ITS1片段长度均为165bp，ITS2 片段长度均为158~160bp, 5.8S 片段长度为均为159bp。8种不同产地的山药ITS1和ITS2区分别有6个和9个碱基变异。结论利用ITS 区序列的差异鉴别不同产区的山药提供了依据。
       关键词：山药；  ITS区序列；  聚合酶链反应
       Comparison of Ribosomal DNA ITS Sequence of Rhizoma Dioscoreae in Different Geographical Regions
       WANG Dong,BAI Yan,CHEN Zhihong
       （Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan  450008,China）
       Abstract：ObjectiveTo distinguish Dioscoreaeu opposita Thunb. from different geographical regions by comparing Ribosomal DNA ITS sequence. MethodsDirect PCR sequencing was used to detect the homology of rDNA ITS sequence.ResultsEight Dioscoreae opposita Thunb. were obtained from different geographical regions by PCR technology. Sequence analysis showed that ITS1 was 165bp, ITS2 was 158~160bp and 5.8S was 159bp. There were 6 various sites in ITS1 and 9 various sites in ITS2 .ConclusionIt provides the basis for identifying Dioscoreae opposita Thunb. from different geographical regions according to the variation of the ITS sequences.
       Key words：Dioscoreae opposita Thunb.；  ITS sequences；  PCR
   
　　山药Rhizoma Dioscoreae为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的块茎，属多年生缠绕草本植物。是我国最大众化的传统保健食品之一，除了少数热带地区外，几乎各地都有栽培，可分山地生、平地生、也有野生的。山药集中产于河南、陕西、山东等地区；在诸多品种中，以河南的“怀山药”最负盛名，其品质优良，既是食用的佳蔬，又是入药的道地药材，为历史上著称的“四大怀药”之一。 山药具有补脾养肺、生津益肺、补肾涩精的功能，主治脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳、肾虚遗精、带下、尿频、虚热消渴等症。目前，道地药材多为栽培种植生产，由于种种原因，这些品种之间质量参差不齐，各品种的种质资源在形态特征、产量、质量及抗病性等方面均有较大差异，各品种间遗传背景、亲缘关系尚不清楚，传统的优良品种很难确定。长期以来的这些相关研究大多限于形态、化学、药效等方面，多停留在利用现代仪器分析技术对道地药材质量优劣进行比较和评价，很少从生物学水平上，特别是从分子生物学水平上对道地药材的形成机理进行深入的探讨。因此，为了鉴定和评价道地药材品种内性状的变异和品质差异及不同种质之间的亲缘关系，克服用传统鉴别方法不易区分品种的缺点，亟待分子生物学技术对山药种质资源进行研究。随着DNA 分析技术的发展,PCR 测序方法已经被应用到了中药品种鉴别领域［1］，在采用传统形态学、化学方法很难鉴别不同产地的山药情况下，虽然rbcL，18SrRNA 序列标记不失为一种有效的分子手段，但是由于叶绿体rbcL和核rDNA基因比较保守,进化速率远低于叶绿体赖氨酸－tRNA 内含子成熟酶基因(matK) 和核糖体非编码转录区(ITS) 基因［2］高等植物核糖体DNA (rDNA)的每个重复单位从5"端开始,包括外转录间隔区(external transcribed spacer,简称ETS)、18S基因、第一内转录间隔区(internal transcribed spacer1，简称ITS1)、5.8S 基因、第二内转录间隔区( ITS2) 和26S 基因,重复单位之间为基因间隔区(intergenic soacer，简称IGS) 称为非编码区(non - transcribed spacer ,NTS)。rDNA 的编码区序列(18S、5.8S 和26S基因) 选择压大，属高度保守区。非编码区序列(如IGS，NTS) 是高变区,选择压小得多，序列差异主要表现在该区上。而ITS 区是中度保守区，序列的变异度处于两者之间，存在种内多态性［3~5］。为探讨不同产地山药分子生物学方面的差异，本实验采集了8个不同产区的山药栽培和野生样品，采用PCR 直接测序技术进行了山药rDNA ITS区序列的测定，并用phylip3.6软件进行了分析，从分子水平上比较不同地区山药的差异。
       1  材料与方法
       1.1  样品本实验所用山药为供提取DNA及ITS测序的不同品种山药叶片采自河南省的温县、武陟及山西、山东、河北、广东、广西等产地的比较有代表性的8个样品，采用硅胶快速干燥，4℃保存。原植物经河南中医学院生药教研室陈随清博士鉴定学名。所有凭证标本存于河南中医学院分析测试中心实验室。
       1.2  试剂与仪器DNA 微量提取试剂盒和PCR 扩增产物纯化试剂盒(均为北京天为时代科技有限公司)。Tris碱(上海爱紫特生物科技有限公司)，TaqDNA 聚合酶，10×Taq 缓冲液、dNTP (上海 Sangon 公司)，PCR 扩增引物(上海博亚生物技术有限公司)，琼脂糖(上海爱紫特生物科技有限公司)，其他溶剂均为分析纯。D-37520 型台式离心机(德国Eppendorf 公司) , PTC-100 型PCR 仪( 美国MJ Research 公司)，电泳仪(DDY- Ⅲ，北京六一仪器厂) ，凝胶成像系统( 上海四星生物技术公司)。
       1.3  总DNA 制备将实验用药材在液氮中研磨成细粉，用DNA提取试剂盒（北京天为时代科技有限公司）按说明书操作提取总DNA 。吸取DNA 溶液5 μl在1.0 %琼脂糖凝胶上用0.5×TAE 电泳缓冲液电泳仪中电泳，EB 染色，UV灯光下照相。DNA 长度与λ-HindIII(TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司) 分子标记物比较。
       1.4  ITS片段的PCR 扩增PCR扩增引物为1p 5" -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"，2p：5"-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGC-3"。反应体积50μl，其中含有dNTPmix（dATP dCTP dGTP dTTP 每种2.5 mmol/L）0.3 μl，0.25 μmol/L 引物2 μl，1U TaqDNA聚合酶0.5 μl及10×Taq 缓冲液5 μl，置于PCR 仪，按下述参数进行1 个PCR 循环：94 ℃，3 min。然后按下述参数进行35 个PCR 循环：94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，2 min。最后按下述参数进行1 个PCR 循环：72 ℃，5 min。取PCR 反应液3 μl于1.5 %琼脂糖凝胶上用1×TBE 电泳缓冲液于电泳仪中电泳， EB染色，UV 灯光下照相。DNA 长度与2 kb DNA marker 分子标记物(TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司) 比较。取目标产物条带用胶回收纯化试剂盒（北京天为时代科技有限公司）进行纯化。
       1.5  测序PCR纯化产物直接用于测序循环反应。测序引物为通用引物1p。采用双脱氧末端终止法按Thermo Sequenase 循环测序试剂盒(Amersham Life Science 公司) 实验指南进行测序。测序反应每管反应体积为5.0 μl，内含3.0 μl纯化的PCR 产物，0.2 μl测序引物(10 μmol/ L)，1.8 μl dNTP混合试剂，循环测序反应条件：95 ℃，5 min，1 个循环。95℃，30 s；55℃，30 s；72℃1 min，40 个循环。测序反应结束后加3   μl测序终止缓冲液，离心混匀。取1 μl 测序反应液上样于4 %聚丙酰胺- 7 mmol/ L 尿素凝胶电泳板于测序仪进行测序。
       1.6  序列数据分析用CLUSTAL×(1.83) 软件对8个品种山药ITS序列进行对位排列，然后手工校正，去除18 s和26 s端得到ITS1-5.8S-ITS2片段长度为482 bp。得到的序列用phylip3.6软件进行系统发生分析。并以最大简约法(Maximum Parsimony (MP) method)构建系统分支树。
       　　2  结果
       提取的总DNA经测定其浓度在120~150 ng/mg之间，经引物扩增后可得到700 bp左右的清晰条带（见图1~3）。
       1.山东济宁  2.太行野生  3.大封驾部  4.广东参薯  5.山西太谷　6.广西参薯  7.山西平遥  8.河北安国  M：2kb ladder 分子标记物
       图1  不同产地山药 rRNA ITS 序列PCR 扩增图谱（略）
       图2   不同产地山药ITS 序列变异位点比较（略）    
       各产区山药样品的ITS 序列之间存在不同差异（见表1）。各产区山药的遗传距离(p-distance) 范围为0. 000 0～0.006 2。
       表1  不同产地山药ITS 序列同源性(右上角) 和碱基变异位点数(左下角)（略）
       图3  不同产地山药的最大简约树（Mp Tree）是根据Fitch-Wagern简约法重建，应用PHYLIP3.6中的Consense完成（略）
       　　3  讨论
       通过最大简约法构建的系统树，以Bootstraping法分支分析,以怀山药（产于河南省焦作市大封驾部）基准,产于太行山的野生山药差异较大D= 0.017 03 ,先聚为一支。再与山东济宁产的山药D= 0.004 48与参薯（广东参薯D= 0.00486与广西参薯D= 0.004 48）,共组成一个分支。而山西平遥产山药D= 0.004 76与山西太谷产山药D= 0.004 27基本没有差异，它们和河北安国产山药D= 0.004 36共同与怀山药有较大的同源性，通过ITS序列分析，这几种不同产地的山药之间碱基仅相差几个，提示它们具有同源性；野生山药与种植山药碱基数目相差较大，说明种植山药在驯化过程中产生了变移，使物种更进化。由于太行野生、山东济宁、河南大封驾部、河北安国、山西平遥、山西太谷、广西参薯和广东参薯产的山药ITS 序列有着不同的变异，而河南产的山药为地道产区，因此可以把这些产区的山药ITS 序列设为标准，而其他产地的山药ITS序列的差异为各自的指纹图谱，用以作为鉴别来自不同产地山药的参考。
       参考文献：
       ［1］  Cao H, L iu Y P, Komatsu K, et al. DNA molecular prof iling : A new approach to quality cont rol of Chinese drugs ［J］. Chin J Integ Trad Western Med, 2000, 6 (1) :71.
       ［2］  Wolfe KH, Li WH , Sharp PM. Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAs. Proc Natl Acad Sci USA ［J］.1987, 84 (5):9054.
       ［3］  Ainouche M L, Bayer R. On the origins of the tetraploid Bromus species (Section Bromus, Poaceae): insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA［J］.Genome, 1997, 40 :730.
       ［4］  Buckler E S, Holtsford T P. Zea systematica : ribosomal ITS evidence［J］.Mol Biol Evol , 1996 , 13 : 612.
       ［5］  Downie S R, Katz, Downie D S. A molecular phylogeny of Apiaceae subfamily Apioideae: evidence from nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences［J］.Amer J Bot , 1996, 83 : 234.

　　基金项目：河南省自然科学基金资助项目（No.004025000）
       (河南中医学院，河南 郑州  450008)