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       【关键词】  夏枯草；,,乌索酸；,,齐墩果酸；,,反相高效液相色谱法
       摘要：目的建立同时测定夏枯草中乌索酸及齐墩果酸含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法。色谱柱为 Nucleodur C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇:水（86∶14），流速为0.8 ml/min，检测波长为210 nm，柱温25 ℃。结果乌索酸进样量在0.425 2 ～3.826 8 μg，齐墩果酸进样量在0.127 2 ～1.144 8 μg范围内，线性关系良好，乌索酸、齐墩果酸的加样平均回收率分别为98.0 %和98.7 %，RSD分别为1.0 %和1.4 %。结论方法简单准确，重现性好，适用于夏枯草药材的质量控制。
       关键词：夏枯草；  乌索酸；  齐墩果酸；  反相高效液相色谱法
       Determination of Two Triterpene Acids in Prunella vulgaris L. by RP-HPLC
       ZOU Sheng-Qin, JIANG Bai-quan, CHEN Wu
       （School of Environmental Science and Engineering, Nanchang University, Nanchang 330029, China; Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines, Bioengineering Research Institute of Yichun University, Yichun 336000, China）  
       Abstract：ObjectiveTo develop a new method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L．MethodsThe high performance liquid chromatography was used．The column was Nucleodur C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm) column，the mobile phase consisted of methanol - water (86∶14) , the flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear range with good linearity of ursolic acid was between 0.425 2 ～3.826 8 μg and with the oleanolic acid was between 0.127 2 ～1.144 8 μg．The average recovery of ursolic acid was 98.0 % with relative standard deviation (RSD )of 1.0 % and the oleanolic acid was 98.7 % with RSD of 1.4 %.ConclusionThe method is simple, accurate, reliable and can be used for quality control of Prunella vulgaris L．
       Key words：Prunella vulgaris L;  Ursolic acid;  Oleanolic acid;  RP-HPLC
   
　　夏枯草Prunella vulgaris L.是唇形科夏枯草属植物，为中医临床常用中药，始载于《神农本草经》，主产于河南、安徽、江苏、浙江等地，以干燥果穗或全草入药，味辛苦、性寒，具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，用于目赤肿痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等［1］。现代临床多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压病、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病。夏枯草中含有三萜及其苷类、苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素类、有机酸类、挥发油等多种活性化学成分 ［2~4］，其中乌索酸和齐墩果酸为夏枯草的主要活性成分［5~6］。目前夏枯草中两种三萜酸含量的测定，文献报道主要采用薄层色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法和毛细管胶束电动色谱法［7~10］。本实验建立高效液相色谱法同时测定了夏枯草中乌索酸和齐墩果酸的含量，旨在为控制夏枯草内在质量提供依据。
       　　1   仪器与材料
       1.1   仪器  Waters515高效液相色谱仪，2296光电二极管矩阵检测器，7725I进样阀，Empower中文色谱工作站；KS-1500超声清洗器（宁波科声仪器厂），CP225D准微量天平（德国 Sartorius公司），UPWS-I-10T纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂），FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。
       1.2   试剂与材料 甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，乙醇为分析纯（95 %，江西同盟试剂厂），乌索酸、齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：110742-200314，110709-200311），夏枯草（市售）。
       　　2  方法与结果
       2.1   色谱条件和系统适应性色谱柱为Nucleodur C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，带保护柱，流动相为甲醇-水（86:14），流速为0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温25℃，外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10 000。对照品及夏枯草样品的 HPLC色谱见图1。
       a对照品  b夏枯草样品  1.齐墩果酸  2.乌索酸
       图1  对照品和夏枯草样品的 HPLC色谱图（略）
       2.2  溶液的配制
       2.2.1   对照品储备液精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品21.26 mg，齐墩果酸对照品6.36 mg，置于10 ml容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容，摇匀，作为乌索酸和齐墩果酸对照品储备液，备用。
       2.2.2   夏枯草样品溶液将药材夏枯草在80 ℃下恒温干燥12 h，取适量夏枯草于高速万能粉碎机中粉碎，备用。精密称取夏枯草粉末约2 g，置具塞三角烧瓶中，加入95 %乙醇溶液30 ml，超声提取120 min，放冷，滤过，滤渣再加入少量乙醇，超声洗涤2次，合并滤液至50 ml容量瓶中，乙醇定容，摇匀，得样品溶液。
       2.3   标准曲线的绘制精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品储备液1 ml至10 ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，制成含乌索酸0.212 6 mg/ml，齐墩果酸0.063 6 mg/ml的对照品混合溶液。分别吸取2 ，6 ，10，14 ，18 μl，按2.1色谱条件进样测定峰面积，以峰面积（μV・s）为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行线性拟合，得乌索酸回归方程为 Y=5.18×105X-1.35×103，r=0.999 84；齐墩果酸回归方程为 Y = 3.28×105 X-1.90×103，r=0.999 60，表明当乌索酸进样量在0.425 2～3.826 8 μg，齐墩果酸进样量在0.127 2～1.144 8 μg范围内，线性关系良好。
       2.4   精密度实验  精密吸取乌索酸和齐墩果酸的对照混合溶液20 μl进样，乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为0.6 %（n=5），齐墩果酸的峰面积 RSD 0.9 %（n=5）。结果表明仪器系统精密度良好。
       2.5  重现性实验 精密称取同一批夏枯草样品5份，每份约2 g，按样品溶液配制方法制备溶液，精密吸取20 μl 进样分析，乌索酸峰面积 RSD为1.1 %（n=5），齐墩果酸峰面积 RSD为1.2%(n=5) 。
       2.6   加样回收率实验精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的夏枯草样品5份，每份约1 g，分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品储备液1.0 ml，制备样品溶液。精密吸取20 μl进样分析，得乌索酸的平均加样回收率为98.0 %，RSD为1.0 %，齐墩果酸的平均加样回收率为98.7 %，RSD为1.4 %。
       2.7  样品分析结果精密吸取样品溶液20 μl进样，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定样品中乌索酸和齐墩果酸的峰面积，平行3次，计算样品中乌索酸和齐墩果酸的平均含量。结果见表1。
       表1  夏枯草样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果（略）
       　　3  讨论
       3.1   样品提取方法的选择夏枯草中乌索酸和齐墩果酸的提取多采用乙醇回流法［11］和乙醚索氏提取法，操作时间长，提取工艺复杂，提取率低，而采用超声波提取夏枯草中的两种有效成分，操作简单，提取时间短，提取率高，有利于样品中有效成分的快速富集，具有快速、环保、节省溶剂等优点，提取液中杂质较少，样品经0.45 μm滤膜过滤后可直接进样，对色谱柱无污染。
       3.2   样品提取时间的选择考察了不同提取时间对样品中乌索酸提取率的影响。当夏枯草样品超声提取120 min后，继续延长提取时间，提取率无明显变化，确定样品的提取时间为120 min。
       3.3   检测波长的选择采用光电二极管矩阵检测器，在190~500 nm波长范围进行光谱扫描，乌索酸和齐墩果酸在流动相中的最大吸收波长均为202.2 nm（见图2），但短波长处流动相有较强的末端吸收，为避免流动相对检测结果的干扰，提高信噪比，保证系统的灵敏度，选取210 nm为检测波长。
       1.齐墩果酸  2.乌索酸
       图2  乌索酸和齐墩果酸对照品的紫外光谱图（略）
       3.4   流动相和色谱柱的选择乌索酸和齐墩果酸均属三萜类化合物，为同分异构体，两者极性几乎无差别，分离较困难，传统检测方法在测定夏枯草中乌索酸含量时，未能将齐墩果酸和乌索酸分离，测得的乌索酸含量实际为两者的总和。经多次实验，以甲醇-水（86∶14）体系为流动相，选用 Nucleodur C18柱实现了乌索酸和齐墩果酸的良好分离。
       　　参考文献：
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       基金项目：国家“863”计划资助项目（No.2002AA2Z3217）
       (南昌大学环境科学与技术学院，江西 南昌  330029；江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春学院生物工程研究所，江西  宜春  336000)