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       【关键词】  枸杞；,,基因组DNA；,,RAPD；,,指纹图谱
       摘要：目的建立一种适于RAPD分析的快速提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并利用RAPD技术研究枸杞属植物基因组DNA指纹图谱。 方法采用改进的CTAB法提取枸杞冷藏幼叶的基因组DNA，利用RAPD技术对其进行指纹图谱分析。 结果改进的CTAB法提取的10份枸杞材料基因组DNA均适于RAPD分析；可提供清晰的RAPD指纹图谱，利用筛选出的2个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增，共得到56条带，其中多态性条带44条，多态性百分率为78.6%。 结论 表明改进的CTAB法提取的枸杞基因组DNA不需经氯化铯梯度离心或柱层析纯化，可以直接用于RAPD分析；RAPD对枸杞属植物进行指纹图谱分析是可行的。
       关键词：枸杞；  基因组DNA；  RAPD；  指纹图谱
       Extraction of Genomic DNA from Lycium bararum and Its Fingerprint Analysis
       YAN Fengkun， XU Xing*， WEI Yuqing， YONG Lihua， ZHENG Guobao
       (Life Science School of Ningxia University, Yinchuan 750021, China； Key Lab of Agricultural Bio-technology of Ningxia, Ningxia Academy of Agricultural and Forestryial Sciences, Yinchuan 750002, China； Agricultural College of Ningxia University, Yinchuan 750021, China)
       Abstract：ObjectiveTo develop valid method to extract DNA from Lycium bararum for RAPD analysis and research its DNA fingerprint by using RAPD technology. MethodsThe extracts of high quality genomic DNA was extracted from the frozen leaves of Lycium bararum by modified CTAB method and its fingerprint was analyzed by RAPD. ResultsThe clear fingerprints of the extracts of genomic DNA could be got by RAPD. Two RAPD primers were applied to do random amplification. A total of 56 DNA bands was detected, 44 among which were polymorphic, the average rate of polymorphic bands was 78.6%.ConclusionThe modified CTAB method was valid,quick and didn＇t need phenol extraction. This isolated DNA could be used directly for RAPD analysis without sedimentation in cesium chloride gradient or column chromatography.The RAPD markers can be used for the studies of fingerprint of Lycium bararum sensitively.
       Key words：Lycium bararum;  Genomic DNA；  RAPD；  Fingerprint
   
　　RAPD由Williams和Welsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术［1,2］，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术。RAPD标记所需样品基因组DNA的量仅为10 ng，且RAPD引物已商品化生产。因此，它可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性，尤其在目前绝大多数动、植物中药材DNA序列尚不清楚的情况下，在中药品种研究方面RAPD标记比其它分子标记更具有广阔的应用前景［3］。虽然DNA分子标记技术在枸杞属植物鉴定等方面已有一些报道，张艳波等［4］收集了6种枸杞属植物，其中2个正品，4个混淆品种，运用RAPD技术进行分析，获得了枸杞属不同种的特异性DNA指纹图谱，从而将它们准确区别。郑可大等［5］收集了20个台北市场枸杞商品，运用RAPD技术进行分析，获得了2个DNA指纹图谱类型，推测其中15个是正品枸杞，5个混淆品。魏玉清等［6］对宁夏不同地区主栽枸杞品种利用RAPD技术进行了鉴别。但目前分子标记用于枸杞属植物研究的种类和数量都十分有限，本实验所选的部分枸杞材料未见有RAPD研究报道。获得高质量的DNA样品是进行RAPD分析的首要步骤。目前，有许多植物基因组DNA提取方法［7～9］。要用于RAPD分析，DNA提取步骤越少越好，能减少对DNA的破坏；多步骤、多种试剂容易引起DNA的破坏和污染，从而影响PCR反应及PCR扩增产物的结果分析。关于从枸杞果实中提取基因组DNA有一些报道［4,5～10,11］，而有关从枸杞叶片中进行基因组DNA提取与PCR分析的详细研究尚未见报道。枸杞(Lycium bararum)叶内多糖等物质含量较高，这些次生物质与DNA形成复合物，这种DNA不能用于PCR扩增。为了解决这个问题，最理想的办法是用氯化铯梯度离心或柱层析纯化DNA，但此法昂贵、费时，且需大量试材。本研究力图通过实验建立一种简易的提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并对其进行RAPD鉴定，从而在此基础上进行RAPD指纹图谱分析。
       　　1   材料与方法
       1.1   材料实验所用的10份材料及来源见表1（野生枸杞为野外获得的一棵外形不同于宁夏主栽品种的植株）。
       表1   材料名称（略）
       1.2   仪器与试剂PCR仪（PTC200TM Peltier Thermal Cycler，M J Research，Inc，USA）；电泳仪（DYY10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM 3000核酸蛋白测定仪（BIORAD Lab，Inc，USA）；Eppendorf 5415D离心机；UVP GDS8000凝胶成像系统。Buffer，Taq DNA 聚合酶，dNTPs，MgCl2，300bpDNA ladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士Fluka Chemika公司）。
       1.3   方法
       1.3.1  基因组DNA提取采用CTAB法［12～15］，并适当改进。具体步骤为：①枸杞幼叶在液氮中研磨至无可见组织块后装入1.5 ml的Eppendorf管中（大约1/3体积），加入500 μl提取缓冲液〔含100 mmol/LTrisHCl（pH 8.0），20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl，2%CTAB，0.2%β巯基乙醇〕，混匀，65℃温育30 min，取出立即放入冰中冷冻10 min。②加入500 μl的氯仿异戊醇（24∶1），混匀，于4℃冰箱中冷冻10 min，12 000 r/min离心10 min，转移上清液于干净的1.5 ml的Eppendorf管中，重复1次。③加入300～500 μl的异丙醇或1ml的无水乙醇混合，于-20℃下静置20 min。12 000 r/min离心15 min，弃上清液，先加入70%乙醇洗沉淀两次去除有机溶剂、无机盐等，然后加入无水乙醇脱水，室温干燥。④将干燥DNA溶解于200 μl的ddH2O或TE缓冲液（含10 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L EDTA，pH8.3）做母液于-20℃储存。将DNA母液取出10 μl稀释40倍后，用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪测波长260，280及320 nm处光吸收，直接从仪器主屏上读出被测样品A260，A280，A260/A280和DNA含量。点6×上样缓冲液10 μl于玻璃板上，分别吸取各材料DNA母液2 μl与其混匀，然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳（72 v电压下电泳30 min），检验DNA片段大小。最后将DNA母液稀释为20 ng/μl的工作液分装成小包装于-20℃储存或4℃保存备用。
       1.3.2  PCR扩增及电泳检测反应在PTC200型PCR仪上进行。采用本实验室长期使用的20 μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8 μl 25 mmol・L-1 Mg2+，1 μl  2.5mM dNTPs，1UTaq DNA聚合酶，1 μl 0.375 μm 10碱基随机引物，50 ng模板。反应程序：预变性94℃ 2 min；预扩增程序：94℃ 20s，36℃ 30s，72℃ 1min，5个循环；扩增程序：94℃ 20s，40℃ 30s，72℃ 1min，40个循环；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。扩增产物经含有0.5 μg/ml EB的1.4%琼脂糖凝胶电泳分离（72 v电压下电泳45 min），电泳结束后在UVP GDS8000凝胶成像系统上观察照相。
       1.3.3   RAPD随机引物筛选用一种材料做完20个引物后，去除只扩增出3条带以下或没有条带的引物，再用另一种材料依次筛选下去。筛选出多态性较强、重现性好的引物2个（S331：5’CTCAGTCGCA3’和S2063：5’GAGCCCCGAA3’）。
       　　2  结果
       2.1  改进的CTAB法成功提取了枸杞叶片基因组DNA本实验在参考CTAB法基础上适当改进，成功提取了枸杞基因组DNA，该方法不需饱和酚抽提、氯化铯梯度离心和柱层析纯化，可直接用于RAPD分析。
       2.2  枸杞基因组DNA质量检测采用改进的CTAB法所提枸杞的DNA颜色为透明的白色、干后无色。
       点样孔1～10分别对应1～10号供试材料
       图1  枸杞基因组DNA电泳图（略）
       由图1可看出，枸杞基因组DNA经电泳检测在点样孔附近呈一条亮且集中的条带，说明DNA未降解；亮带前面的条带经RNase处理后不再存在，说明这些条带为RNA。
       表2  基因组DNA纯度及含量检测（略）
       由表2可看出，波长260 nm和280 nm光吸收比值在2.08～2.53之间，DNA含量在712～2 870 μg/ml之间。
       2.3  模板浓度对扩增结果的影响我们实验室长期使用50 ng/20 μl体系的模板DNA浓度，RAPD标记所需样品基因组DNA的量仅为10 ng［3］，于是我们设计了10 ng/20 μl体系、20 ng/20 μl体系、50 ng/20 μl体系3个模板浓度对扩增结果的影响。本实验用了1个筛选过的随机引物（S1：5’GTTTCGCTCC3’）S3：5’对3种材种（2号宁杞1号、4号血杞1号和5号精杞1号）材料进行浓度梯度试验。由图2可知，反应体系中模板DNA浓度为10～50 ng/20 μl体系时扩增结果没有明显区别；由于实验室习惯，我们选用了50 ng/20 μl体系的模板DNA浓度。
       图2  不同模板DNA浓度扩增结果（略）
       2.4   枸杞基因组DNA指纹图谱分析
       2.4.1  筛选的2个随机引物对10份材料基因组DNA的扩增由于RAPD随机引物10个碱基太短，而且退火温度较低（36～40℃），很容易造成错误配对，再加上各种试剂的质量和浓度差异，造成扩增出现假阳性带型和结果的不稳定。因此，在本实验利用RAPD技术时，笔者首先对实验室长期使用的反应体系进行了优化，然后以10份供试材料的DNA为模板，运用筛选出的2个RAPD引物分别扩增，扩增结果如图3～4所示，扩增出的DNA带的分子大小在500～2500 bp之间；2个引物扩增的条带数量以及区分10份供试材料（6类，野生枸杞不计入）的区分率均存在差异，2个引物扩增6类材料的条带数量分别为23条和33条，平均每个引物扩增28条带；扩增的具有多态性的条带分别为17条和27条，平均每个引物扩增22条具有多态性的带，其统计分析结果如表3所示，从表3统计结果可知，区分6类供试材料的区分率分别83.3%（S331不能区分2和3）和66.7%（S2063不能区分2和3及4和9），平均为75%。两个引物共扩增出56条清晰条带，其中44条具有多态性，多态性比率（PPB）达78.6%。
       2.4.2  指纹图谱解析由图3、图4和表3可知，运用筛选出的S331和S2063两个引物仅不能区分2和3（宁杞1号和宁杞2号）。虽然引物S331扩增的条带数量和具有多态性的条带数量均比S2063的少，但引物S331扩增条带的清晰度比S2063的要好，且区分6类供试材料的区分率比S2063的高，扩增出现假阳性带型和结果不稳定性的机率大大减少，综合各种结果可看出，引物S331比S2063的扩增效果要好。从图3~4可知，2，6，7和8（不同地方的宁杞1号）指纹图谱一致，2和3仅在S331扩增出的500 bp处共有带的亮度不同，不能有效地进行区分，其它种类可以有效地进行区分，说明RAPD技术用于不同品种枸杞的鉴别是有效的。
       M：300bp DNA ladder（2500，2000，1500，1000，500，300）
       CK：阴性对照（不加模板DNA）
       点样孔1～10分别对应1～10号供试材料
       图3  引物S331扩增10份DNA样品的结果（略）
       M：300bp DNA ladder（2500，2000，1500，1000，500，300）
       CK：阴性对照（不加模板DNA）
       点样孔1～10分别对应1～10号供试材料
       图4   引物S2063扩增10份DNA样品的结果（略）
       表3  扩增谱带情况分析（略）
       3  讨论
       3.1  植物药中的小分子次生代谢产物如萜类、黄酮、香豆素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与DNA结合，引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖类由于与DNA同属大分子化合物，一般提取过程很难去除干净，也可能影响DNA的进一步酶处理或PCR扩增［16］。采用改进的CTAB法对枸杞幼叶基因组DNA进行提取，经电泳检测，紫外吸收检测及RAPD分析发现，改进后的CTAB法适合枸杞幼叶基因组DNA提取。采用该法提取的基因组DNA干燥时呈透明的白色，溶于水或缓冲液中无色，说明CTAB除色素及次生代谢物效果好。CTAB是一种去污剂，既能裂解细胞又能有效地沉淀次生代谢物，特别是多糖。由于提取过程未用RNase处理，10份材料基因组DNA的A260/A280均大于2.00，但对上述10份材料DNA样品进行RAPD分析，能获得好的结果（图2~4）。由实验结果可见，枸杞RAPD分析所用的DNA，无需复杂的纯化过程，只需简单的氯仿异戊醇（24∶1）抽提，并且不需去除RNA，但研磨要充分。可见，采用改进CTAB法提取枸杞幼叶基因组DNA，步骤简单，适合进行RAPD分析用，避免了使用苯酚这种有毒试剂。
       3.2  RAPD技术本身存在多态性少和重现性的缺点［17］，对此缺点笔者在实验设计的时候就已经考虑到了。筛选引物时笔者用了3种枸杞材料，选出在3种枸杞材料中均有3条以上条带、并且重复2～3次均能扩增出相同结果的引物进行扩增。选出的引物在一定程度上可以作为枸杞属植物的通用引物，本实验基本上证实了这一点。考虑到枸杞变异较大，中间类型很多，种的界限不清楚，对有些种和品种的形态学分类操作者存在着客观和主观的原因等因素，本实验所用候选引物的数量还不够多，可以再增加，这在一定程度上可以减少实验结果分析的误差，以及种和品种间遗传多样性所产生的影响。
       3.3  随着分子标记技术的发展，各种新的标记技术不断产生，如果要科学、准确地对植物的基因组DNA进行指纹图谱分析，进而对植物的遗传多样性和亲缘关系进行研究还得运用多种分子标记技术，将每一种标记的结果和传统的分类结果进行全面的比较和分析才能获得令人信服的结果。但由于对枸杞属植物的遗传背景了解不多，运用RAPD技术对其基因组DNA进行指纹图谱分析从而进行道地品种的鉴别、遗传多样性及亲缘关系的研究是目前最有效的方法。
       3.4  1（野生枸杞）和2，6，7，8（不同地方的宁杞1号）指纹图谱一致，说明野生枸杞可能是宁杞1号，其植株外形不同于宁夏栽培的宁杞1号可能是受环境的影响发生了形态变异。
       　　参考文献：
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　　基金项目：宁夏自然科学基金重大项目“宁夏枸杞道地性研究”（No.2003ZD01）和国家重点基础研究发展计划（973计划）项目“作物应答高盐、低温胁迫的分子调控机理”第六课题“重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应分析研究”（No.G2006CB100106）共同资助
       (宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川  750021； 宁夏农业生物技术重点实验室，宁夏 银川   750002；宁夏大学农学院，宁夏 银川  750021)