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       【关键词】  固相萃取；,,高效液相色谱；,,黄芪甲苷
       摘要：目的采用固相萃取高效液相色谱方法分析黄芪中黄芪甲苷的含量。方法采用C18固相萃取小柱纯化黄芪提取物中的黄芪甲苷，反相高效液相色谱―紫外检测方法测定黄芪中黄芪甲苷含量。色谱柱为Zorbax SBC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈水（32∶68）为流动相，流速1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长200 nm。结果黄芪甲苷进样量在1.408～7.04 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9。平均回收率为101.5%。结论该方法操作简便，重现性好，可作为黄芪药材或其它含黄芪制剂中黄芪甲苷含量的分析方法。
       关键词：固相萃取；  高效液相色谱；  黄芪甲苷
       Determination of Astragaloside IV in Radix Astragali by SPEHPLC
       YANG Kedi， LI Hong， LONG Yunfei， ZHENG Zhihui， WAN Shungang
       (School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University，Nanning  530004，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish SPEHPLC method for the determination of astragaloside IV in Radix Astragali. MethodsThe astragaloside IV in sample was purified with C18 solid phase column and its content was determined with HPLCUV method. The astragaloside IV was separated on a Zorbax SBC18 column (φ4.6 mm×150 mm, 5 μm) with acetonitrile-water (32∶68, v/v) as mobile phase, and the detective wavelength was set at 200nm. ResultsThe linear range was 1.408～7.04 μg (r=0.999 9). The average recovery of astragaloside IV was 101.5%. ConclusionThe method is simple, accurate and can be used for the quality control of Radix Astragali and its preparation.
       Key words：Solidphase extraction；  HPLC；  Astragaloside IV
   
　　黄芪为常用中草药，具有较高的药用价值，其主要成分黄芪甲苷具有镇痛、镇静和降血压等药理活性［1，2］。2005年版《中国药典》规定采用HPLCELSE方法测定黄芪甲苷含量［3］，鉴于紫外检测器的普及性，目前相当部分实验室仍采用HPLC-UV法分析黄芪及相关制剂中黄芪甲苷含量［4～8］。由于黄芪甲苷的特征吸收波长在200 nm左右， 样品中杂质对黄芪甲苷定量分析干扰较大。目前一般采用D101大孔吸附树脂处理样品，样品中仍含有较多的杂质，黄芪甲苷与其它杂质难以达到基线分离，影响分析准确度，另一方面也不利于色谱柱的保护。本文采用固相萃取方法纯化样品中黄芪甲苷，可明显去除样品中杂质，并以此测定了黄芪药材中黄芪甲苷含量。
       　　1  仪器与材料
       1.1  仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；C18固相萃取柱（美国Bestown公司）；Laborota 4000 旋转蒸发器（德国Heidolph公司）；BS124 S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ500DB超声波清洗机（昆山超声仪器厂）。
       1.2  药材与试剂　黄芪购于南宁市一心药业公司，经鉴定均为药典正品；黄芪甲苷对照品购于中国药品与生物制品检定所（批号0781200311）；乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，双蒸水自制。
       　　2  方法
       2.1  对照品溶液的配制精密称取17.6 mg黄芪甲苷对照品置于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
       2.2  黄芪甲苷供试品溶液的制备　取黄芪药材，粉碎。精密称取4 g粉末，用20 ml甲醇于索氏提取器中浸泡过夜，加甲醇至60 ml，于水浴中80℃下回流提取4 h。提取液挥干甲醇，残渣用正丁醇饱和的水10 ml超声溶解，溶液用水饱和的正丁醇萃取4次，40 ml/次。合并正丁醇液，用1%NaOH溶液洗涤3次，40 ml/次，然后用正丁醇饱和水洗至中性，回收正丁醇，残渣用5 ml水溶解，备用。C18固相萃取柱依次用5 ml甲醇和5 ml水预处理，取黄芪甲苷水溶液过固相萃取柱，先用3 ml双蒸水洗涤，然后用20%甲醇溶液5 ml洗涤，弃去洗涤液。用60%甲醇20 ml洗脱，收集洗脱液。洗脱液挥干溶剂，用甲醇定容至5 ml作为供试品溶液。
       2.3  色谱条件Zorbax SBC18色谱柱 (4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为乙腈水（32∶68，v/v），流速1.0 ml/min，柱温为30℃，检测波长200 nm。样品谱图见图1，对照品谱图见图2。
       2.4  样品含量测定
       2.4.1  线性范围考察用微量进样器分别取2，4，6，8，10 μl黄芪甲苷对照品溶液进样。以黄芪甲苷对照品峰面积为纵坐标y，黄芪甲苷对照品进样量为横坐标x，进行线性回归，得回归方程：y=72.288 5 x-4.902 5 (n=5)，r=0.999 9，线性范围为1.408～7.04 μg。
       2.4.2  黄芪甲苷含量测定分别测定了批号为20050316，20051125两批黄芪药材中黄芪甲苷的含量。结果见表1。
       图1  黄芪甲苷供试品液相色谱图（略）
       图2   黄芪甲苷标准品液相色谱图（略）
       表1  黄芪中黄芪甲苷的含量测定结果（略）
       2.4.3  精密度实验精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10μl，按2.3色谱条件重复进样5次，测定峰面积，黄芪甲苷峰面积RSD=0.87%。
       2.4.4  加样回收率实验精密称取已知黄芪甲苷含量的黄芪2.0 g，加入适量黄芪甲苷对照品，按2.2方法制备供试品溶液，按照2.3的色谱条件测定黄芪甲苷含量，计算黄芪甲苷平均回收率。结果见表2。
       表2   回收率实验结果（略）
       　　3  讨论
       3.1  《中国药典》及较多文献采用氨试液去除黄芪甲苷样品液中的酸性成分。作者参考文献［4］，对氨试液及1%NaOH溶液的去杂效果进行了比较，通过观察处理后的样品液颜色及进行色谱分析。结果表明，1% NaOH溶液洗涤效果较氨试液好，能更好地去除样品中黄酮等含酚羟基的酸性杂质。
       3.2  黄芪甲苷样品通常采用D101大孔树脂吸附纯化，HPLC分析表明其纯化效果不理想，样品中杂质较多，黄芪甲苷峰与杂质峰不能得到基线分离。经比较，采用C18固相萃取柱纯化样品，得到的样品液干扰物较少，黄芪甲苷分离效果较好。
       3.3  实验探讨了黄芪甲苷样品的固相萃取方法和条件。黄芪甲苷的反向固相萃取优于正相固相萃取；样品负载在C18萃取柱上后，依次用3 ml水、20%甲醇溶液5 ml冲洗柱子，能有效地去除样品中极性杂质，然后采用60%甲醇20 ml可完全洗脱黄芪甲苷，所得样品液杂质相对较少，有利于样品分析。
       3.4  实验表明，黄芪甲苷样品经固相萃取处理，HPLC分析结果具有较好的准确性和重现性，SPEHPLC可作为黄芪或其它黄芪制剂中黄芪甲苷的含量分析方法。
       　参考文献：
       ［1］  张银娣，王幼林，沈建平，等．黄芪皂苷甲镇痛、镇静作用［J］.南京医学院学报，1984，4（4）：225.
       ［2］  张银娣，王幼林，沈键平，等．黄芪皂苷甲的抗炎和降压作用［J］.药学学报，1984，19（5）：333.
       ［3］  国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部 ［S］.北京：化学工业出版社，2005：212.
       ［4］  贺福元，刘平安，邓凯文，等．反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中补阳还五汤中黄芪甲苷的含量及药动学研究［J］.中国药学杂志，2005，41(21)：1647.
       ［5］  伍  毅，郑国．HPLC测定复聪香液中黄芪甲苷的含量［J］.中国中药杂志，2005，30 (12)：945.
       ［6］  张莲珠，汲立伟，吕雪峰．HPLC测定克尼胶囊中黄芪甲苷的含量［J］.中成药，2005，27 (8)：991.
       ［7］  戴军平，刘秀霞，吴  沉，等．HPLC法测定黄芪口服液中黄芪甲苷的含量［J］.西北药学杂志，1998，14（4）：149.
       ［8］  郭洪祝，刘晓峰，于  ，等．高效液相色谱法测定胰复康胶囊中黄芪甲苷含量［J］.中国中药杂志，2000，25（10）：609.

　　基金项目：广西教育厅资助项目［项目批准号：桂教科研（2004）20］.
       （广西大学化学化工学院，广西 南宁   530004）