河南不同产地与年限桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
作者：李喜凤，薛秋萍， 董诚明，许闽
《时珍国医国药》 2007年 第1期
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【关键词】 桔梗；,,蛋白质；,,同工酶；,,聚丙烯酰胺凝胶电脉
摘要：目的鉴定河南省内不同产地与年限的桔梗药材。方法利用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，作蛋白质、过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶分析。结果各样品的蛋白质电泳图谱基本一致，同工酶酶谱有共有带，但酶带数量与活性强度却有差异。结论 PAGE分析快速、灵敏、技术简单，可用于桔梗药材的鉴定与质量评价。
关键词：桔梗； 蛋白质； 同工酶； 聚丙烯酰胺凝胶电脉
PAGE Analysis for Radix Platycodon Grandiflorum in Various Ages from Different Places of Henan
LI Xi feng, XUE Qiu ping, DONG Cheng ming, XU Min
(Henan College of TCM, Zhengzhou 450008,China)
Abstract：ObjectiveTo distinguish Radix Platycodon grandiflorum in various ages from different places.MethodsThe protein, peroxidase isozyme and esterase isozyme of Radix Platycodon grandiflorum were studied by means of polyacrylamide gel electrophoresis.ResultsThere was little difference to a certain extent on their protein PAGE;the zymogram of the peroxidase isozyme and esterase isozyme of different Radix Platycodon grandiflorum consisted of common bands,but they had more or less difference in the number of isozymic bands and in their activity intensity. ConclusionPAGE has many advantages such as fast,high sensitivity and simple operation.It can be used for identification and quality evaluation of Radix Platycodon grandiflorum.
Key words：Radix Platycodon grandiflorum; Protein; Isozyme； Polyacrylamide gel electrophoresis
植物类中药细胞内普遍含有受遗传基因控制的蛋白质分子，且具有种的特异性和稳定性，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis 简称PAGE)技术进行蛋白质分析可以达到中药品质的鉴别，已显示出广阔的应用前景。目前该技术在中药材桔梗中的应用主要体现在桔梗与人参、西洋参、三七等其他类药材的区分上，表明种与种之间均具有各自的鉴别特征带，鉴别效果良好［1，2］。本实验首次对不同产地与生长年限桔梗的蛋白质（protein,Pro-）、过氧化物酶（peroxidase isoayme,POD）同工酶、酯酶（esterase isozyme,EST）同工酶进行了PAGE分析，初步探讨了PAGE图谱在桔梗品种鉴别与质量控制中的应用特点。
1 仪器与材料
1.1 仪器 DYY Ш型多用电泳仪、DYY Ш28D型垂直电泳槽、EDAS 290凝胶成像紫外分析仪、LD5 2A低温离心机、LGR16 W型高速冷冻离心机、FA1104型电子天平、SHZ 3型循环水真空泵、真空干燥器、KQ 50型超声波清洗器等。
1.2 试剂 分离胶缓冲液、分离胶贮液、过硫酸铵溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶贮液、40%蔗糖溶液、电极缓冲液、四甲基乙二胺、0.1%溴酚蓝指示剂、考马斯亮蓝染色液、醋酸联苯胺显色液、坚牢蓝染色液、脱色液、琼脂液。所用化学试剂、药品均为分析纯。
1.3 材料 河南省内不同产地与年限的桔梗（Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC. ）药材样品系作者赴产地自行采收，其编号情况见表1。
2 方法与结果
2.1 蛋白质电泳(Pro PAGE)［3］
2.1.1 供试品溶液的制备称取样品(自然干燥)约1 g，加入1 ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液( pH 8.9 )，超声提取30 min，3 500 r/min-1离心20 min，上清液加等体积40%蔗糖溶液混匀，作为供试品溶液，置冰箱内冷藏。
2.1.2 上样与电泳制备浓缩胶浓度3%，分离胶浓度7%。用微量进样器吸取样品提取液20 μl，缓缓注入样品槽底部，在负极槽电极缓冲液中加入1滴溴酚蓝指示剂示踪，开始电泳。电泳开始阶段控制电流15 mA，样品到达分离胶后，电流调整至25 mA。待示踪指示剂行至距琼脂层约1 cm时，关闭电源，停止电泳。整个过程约需3 h，为保证有效散热，电泳在冰箱内进行。
表1 桔梗样品（略）
2.1.3 染色与脱色电泳结束后，打开电泳槽，取出胶板，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿。将胶板浸于考马斯亮蓝染色液中，在恒温培养箱内37℃染色1～2 h，至谱带清晰。胶板染色后，再浸于脱色液中脱色、固定，并经常更换脱色液，至背景清晰。结果见图1～2。
2.2 过氧化物酶同工酶电泳(POD PAGE)［4］
2.2.1 供试品溶液的制备称取样品(鲜品冷冻)约1 g,冰浴研磨，加入1 ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液，冰浴超声提取30 min, 8 000 r/min-1， 0℃离心20 min，上清液加等体积40%蔗糖溶液混匀，作为供试品溶液，置冰箱内冷藏。
2.2.2 电泳与染色电泳按照蛋白质电泳方法进行，浓缩胶浓度3%，分离胶浓度7%。采用醋酸联苯胺染色法，常温下染色，很快出现蓝色谱带，不久即变为棕红色。弃去染色液，凝胶板用蒸馏水冲洗后保存于7%醋酸溶液中。结果图3～5。
2.3 酯酶同工酶电泳（EST PAGE）［4］
2.3.1 供试品溶液的制备 依POD PAGE的方法，提取低温保存的新鲜样品，提取液加等体积10%甘油保存备用。
2.3.2 电泳与染色采用4%的浓缩胶和10%的分离胶，按照POD PAGE同样的操作方法进行电泳，整个过程约需5 h，凝胶采用坚牢蓝染色液常温下进行染色，30 min左右可见桃红色的磷酸酯酶同工酶谱带，最后保存于7%醋酸溶液中。结果见图6～8。
图1 桔梗Pro PAGE电泳图谱（略）
图2 桔梗Pro PAGE电泳图谱（略）
图3 桔梗POD PAGE电泳图谱（略）
图4 桔梗POD PAGE电泳图谱 （略）
图5 桔梗POD PAGE电泳图谱 （略）
图6 桔梗EST-PAGF图谱（略）
图7 桔梗EST-PAGE图谱（略）
图8 桔梗EST-PAGE图谱（略）
3 讨论
3.1 桔梗蛋白质电泳图谱分析从蛋白质电泳图谱可见（图1～2），不同产地与生长年限的桔梗，均显示11条谱带，且谱带位置、颜色深浅是一致的，表明同一种桔梗药材的蛋白质电泳谱稳定性、重现性良好，不受产地与年限的影响。因此，根据蛋白质种的特异性，利用PAGE技术对桔梗进行鉴别是一种迅速有效的方法。
3.2 桔梗同工酶酶谱分析不同产地与年限桔梗的POD同工酶酶谱中（见图3～5），周口各年限桔梗均表现为3条谱带，而桐柏各年限桔梗均表现为一条谱带；各产地除桐柏外，一年生桔梗均表现为3条谱带,两年生桔梗除周口外均表现为一条谱带。EST同工酶酶谱（图6～8）中，桐柏两年生桔梗表现为5条谱带；嵩县两年生桔梗表现为四条谱带；其余样品均表现为3条谱带。可见，不同产地与生长年限的桔梗，无论是过氧化物酶同工酶还是酯酶同工酶，均具有相同的共有谱带，表明它们具有相同的遗传背景，可作为桔梗的特征谱带。同时，同工酶酶谱在数目和级别上又有所差异，说明同工酶分析可用来鉴别从外部形态上难以区分的遗传变异。
3.3 本实验表明，Pro PAGE图谱具有高度的特异性和稳定性，影响因素较少，同时染色用的考马斯亮蓝可以与任何种类的蛋白质发生反应而与生物活性无关，对鲜品及绝大多数的干燥品药材均可使用，适于广泛，可推广应用于桔梗的真伪鉴别与品质评价；同工酶电泳的染色为酶活性染色，只适用于新鲜药材或冷冻保存的鲜品药材，使用范围较窄，但又可弥补蛋白电泳灵敏度不够高、不能反映不同产地与年限药材差异的不足，与有效成分含量相结合，可为药材的规范化种植提供科学依据。
参考文献：
［1］ 石俊英，李定格，宋广远，等.20种根类中药的电泳鉴别［J］.中国中药杂志,1992,17(10)：584.
［2］ 杨九艳,青 梅，杰俊峰，等.人参、西洋参及桔梗的凝胶蛋白电泳鉴别［J］.内蒙古医学院学报,1999,21(4)：256.
［3］ 石俊英，卢 燕，李勃文.蛋白质电泳指纹图谱对北沙参栽培品种鉴定的研究［J］.中国药学杂志,2003,38(3)：171.
［4］ 吴 卫，郑有良，陈 黎，等.川产鱼腥草种质资源的同工酶分析［J］.中药材,2002,25(10)：695.
基金项目：河南省科技攻关资助项目（No.0323032200）
(河南中医学院，河南 郑州 450008)