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       【关键词】  超声波提取；,,多糖；,,湖北地黄
       摘要：目的建立超声波提取湖北地黄多糖的最佳工艺和测定湖北地黄各部分中多糖的含量。方法对超声波提取湖北地黄多糖的条件进行了研究并用蒽酮-硫酸法测定了湖北地黄各部分的多糖含量。结果由正交实验得出超声波提取的最佳条件为：湖北地黄与水的质量比为1∶40，提取温度为40℃，提取时间为30 min。采用蒽酮-硫酸法于624 nm比色，得湖北地黄中各部分多糖含量为：根、茎、叶分别为15.74%，8.36%，4.21%。结论湖北地黄的多糖依据不同提取方法、不同部位含量有较大差异。
       关键词：超声波提取；  多糖；  湖北地黄
       Extraction Technology by Ultrasonic Wave and Content Determination of the Polysaccharide from Rehmannia glutinosa Libosch. in Hubei Province
       TIAN Chunlian， LIAO Boru, CHEN Jianhua，  YAO Yuhong，  ZENG Feng
       (School of Resources and Planning Sciences, Jishou University，Zhangjiajie, Hunan 427000，China)
       AbstractObjectiveTo establish the optimum process of the polysaccharides extraction in seeds of Rehmannia glutinosa Libosch. in Hubei province by ultrasonic wave technology and content determination of polysaccharides.MethodsThe extraction conditions with ultrasonic wave were studied and the contents of  polysaccharides were determined by the anthrone-H2SO4 colorimetric method.ResultsThe optimum process of the technology was abtained through orthogonal test:the ratio of［S］/［L］ was 1∶40,  the extraction temperature was at 40℃ and the extraction time was 30 min. The contents of the polysaccharides were determined by anthrone-H2SO4 colorimetric method (λ=624 nm), and the contents from root, stem and leaf were 15.74%, 8.36%, 4.21% respectively.ConclusionThe content of the polysaccharides in Rehmannia glutinosa Libosch.of Hubei province were different with different extraction mothed and in different part.
       Key words：Extraction  by  ultrasonic wave；  Polysaccharide;  Rehmannia glutinosa Libosch. in hubei province
    
　　地黄是玄参科植物地黄Rehnannia glutinosch Libos.的地茎［1］。为常用中药，始载于《神农本草经》列为上品。鲜地黄性寒、味甘苦，能清热生津，凉血止血、养阴。熟地黄性微温、味甘，能滋阴补血、益津填髓，用于肝肾阴虚，月经不调等症，还具有抗肝瘤、抗病毒、增强免疫功能的效果，其中地黄多糖是一种有效的免疫调节剂，具有抗肝瘤、抗病毒、抗衰老等功效［2］。目前国内外主要对于地黄的化学成分、地黄的主要有效成分的药理作用进行研究［3］，对怀地黄的多糖提取也有过研究［4］，但对于湖北地黄的多糖提取特别是超声波提取还未见报道，因此本文对湖北地黄多糖的超声波提取进行研究，为深度开发湖北地黄这一资源提供依据。
       　　1  器材与方法
       1.1  器材
       1.1.1   材料  湖北地黄于200506采自张家界市永定区后坪镇，洗净，于60℃烘干，粉碎（过40目筛），贮藏备用。
       1.1.2  仪器UV160紫外-可见分光光度计（日本岛津）、B8200-J4超声波（日本岛津）、旋转蒸发仪等。
       1.1.3   试剂石油醚（60～90℃）、95%乙醇、乙醚、丙酮、蒽酮、硫酸、葡萄糖等均为分析纯。
       1.2    方法
       1.2.1  标准曲线的制备［3］精密称取0.100 0 g葡萄糖（105℃烘干至恒重）置于100 ml容量瓶中，稀释10倍后得标准溶液。分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0  ml标准溶液于试管中，加蒸馏水补至1 ml，冰浴，迅速加入4.0 ml蒽酮-浓硫酸试剂，摇匀、冷却，静置5 min后，于紫外分光光度计624 nm处测定吸光值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
       1.2.2  单因素实验
       1.2.2.1   料液比的选择称取0.500 g经石油醚、乙醚、乙醇回流处理的湖北地黄叶15份，分别按1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的料液比加入水，于超声波50℃提取50 min，过滤，定容至100 ml，备测。
       1.2.2.2   提取时间的选择称取0.500 g经石油醚、乙醚、乙醇回流处理的湖北地黄叶15份加入20 ml水，于超声波50℃分别提取10，20，30，40，50，60 min，过滤、定容至100 ml，备测。
       1.2.2.3   提取温度的选择称取0.500 g经石油醚、乙醚、乙醇回流处理的湖北地黄叶15份加入20 ml水，于超声波分别在30，40，50，60，70℃提取30 min，过滤、定容至100 ml，备测。
       1.2.3  湖北地黄多糖提取的最佳组合的选择在单因素实验基础上，选择温度（A）、时间（B）、料液比（C）设计正交，本文选用L9（34）正交表进行实验（见表1），进一步探索最佳提取参数。
       表1  因素水平表（略）
       1.2.4  湖北地黄根、茎、叶中多糖含量的比较在最佳提取条件下，对湖北地黄根、茎、叶进行超声波提取，并进行多糖含量的比较。
       　　2  结果
       2.1   葡萄糖标准曲线根据2.2得出回归方程为 y=0.008 4 x+0.005 1(r=0.999 5)。结果见图1。
       图1  葡萄糖标准曲线（略）
       图2  料液比对湖北地黄多糖含量的影响（略）
       2.2   料液比对湖北地黄多糖含量的影响由图2可看出：料液比在1∶20~1∶50之间，从1∶20～1∶40多糖含量随料液比的增加而增加，料液比为1∶40时含量最高为5.385%，而当料液比为1∶40～1∶50时，提取的多糖含量随料液比的增大趋于稳定。
       2.3   提取时间对多糖含量的影响 由图3可看出：提取时间在30 min以内,多糖含量随着时间的增大而增大；当提取时间大于30 min时，多糖含量变化趋于稳定。因此，提取时间以30 min为最理想。
       2.4   提取温度对湖北地黄多糖含量的影响 从图4可知：当提取温度为40℃时，多糖含量出现最大值为4.714%；而当温度在40～60℃时，多糖含量随着温度的升高而降低；当温度大于60℃时，多糖的含量变化不显著。
       图3  提取时间对多糖含量的影响 （略）
       图4   提取温度对多糖含量的影响（略）
       2.5   不同的提取条件组合对湖北地黄多糖含量的影响见表2～3。
       表2  湖北地黄超声波提取正交表（略）
       表3  方差分析表（略）
       由表2～3可知，影响湖北地黄多糖提取的因素大小是：A温度＞B时间＞C料液比，由于最优组合（A3B2C2）与单因素最好组合（A2B2C2）不相符合，因而，选取各单因素的最好组合（A3B2C2）、正交分析最优组合（A3B2C2）和正交实验组中含量最高的组合（A3B3C2）再次实验，进一步确定提取工艺参数。结果见表4。
       表4  3组合结果比较（略）
       由上表4可看出，各单因素最好的组合（A3B2C2）为最佳的提取条件组合,即提取料液比1∶40，提取时间30 min，提取温度50℃，故本文后续实验用最佳条件进行提取。
       2.6   湖北地黄不同部位多糖含量的比较湖北地黄根中的多糖含量为15.74%，茎8.36%，叶4.21%。根的多糖含量为茎的1.88倍，是叶的3.74倍，而茎的多糖含量是叶的1.99倍。
       2.7  精密度实验  以多糖提取液为样液，蒽酮比色法显色后测定其吸光值。 RSD=0.222%（n=5）
       2.8  重现性实验。以多糖提取液为样液，蒽酮比色法测定其吸度值。 RSD=0.589%（n=5）。
       2.9   显色稳定性实验  以多糖提取液为样液，蒽酮-硫酸试剂显色，显色后开始每隔10 min测1次吸光度值。测12次后，每隔2 h测1次。测3次后，每隔12 h测1次，测2次。结果见表5。
       表5  显色稳定性（略）
       由表5可以看出，显色后60 min内，多糖含量变化不大，60 min后，多糖含量随时间的增长而下降。
       2.10  加样回收实验精密称取湖北地黄叶（挥干试剂后的药渣）0.200 g，加入提取的纯度为27.82%的粗多糖20 mg，置于一烧杯中，以超声波在最佳条件下提取30 min，过滤，稀释10倍后，精密量取1 ml，蒽酮比色法测定吸光值。平均回收率为99.08%
       2.11  除蛋白（sevage法）［4］ 多糖提取液浓缩到原体积的1/5，按浓缩液体积的1/6量加入 sevage试剂（三氯甲烷：正丁醇=4∶1），移入分液漏斗中混匀，静置10 min后，放出下层液体，反复进行（约7～10次），至蛋白质析完为止。多糖浓缩液离心，去除分离的 sevage试剂和悬浮的蛋白质。
       2.12   除色素将提取液用氨水调 pH为5，7，9加入1，2，3倍体积 H2O2于50℃保温30，60，90 min，看各组颜色变化，选出最佳脱色条件，实验安排与分析见表6。从上表中极差 R可以看出 pH对脱色影响最大，其次是保温时间，而影响最小的是 H2O2加入的体积；而且 pH为9， H2O2体积倍数为3倍，保温60 min时脱色效果最好，得到的湖北地黄粗多糖为浅黄色。
       2.13   醇沉脱色后的液体浓缩至50 ml，加入无水乙醇使乙醇含量达到90%，静置48 h后，抽滤得白色粗多糖。
       表6  脱色正交实验与分析（略）  
       　　3  讨论
       3.1  超声波提取湖北地黄中多糖的最佳的工艺参数以水为提取液，且提取料液比1∶40，提取时间30 min，提取温度40℃。并以此条件对湖北地黄的根、茎、叶中多糖进行提取。结果表明，根中多糖含量为15.74%，茎8.36%，叶4.21%。
       3.2   脱色正交实验中保温60 min后颜色都从褐色转变为黄色，有的还比较清亮，pH和10%H2O2加入量对脱色的影响不明显，考虑到强酸性或强碱性条件下可能使多糖水解，且H2O2加入量过大会氧化多糖使其结构发生改变，因而本文选择中性条件下加入1倍量10%H2O2保温60 min进行脱色。
       3.3  本实验利用多糖易溶于水，难溶于有机溶剂的性质用石油醚除去亲脂性强的杂质，如油脂、叶绿素、挥发油等；用乙醚除去树脂及一些极性基团少的化合物，如内脂、黄酮、醌类和弱性生物碱等亲脂性成分，还有单糖和低聚糖；而用水提取其中所含的多糖成分。
       3.4   用蒽酮-硫酸法测定多糖含量方法简便，显色稳定，但在操作过程中，一定要注意硫酸浓度必须为80%以上，否则液体白色不清亮，且加入蒽酮-硫酸试剂后必须摇匀，加热后冷却时也摇匀，否则所测值会与真实值相差很大。 本实验得到的粗多糖的纯度较低，其颜色也为浅黄色，因此，有关湖北地黄多糖的分离纯化有待于进一步的研究。
       　参考文献：
       ［1］  罗献瑞，黄淑美.实用中药彩色图集，第1册［M］.广州：广东科技出版社 ,1992.
       ［2］  徐国钧，王  强，余伯阳.抗肿瘤中草药彩色图谱［M］.福州：福建科技出版社 ,2000.
       ［3］  凌庆枝，敖宗华，尹光耀，等.地黄的研究概况［J］.淮南师范学院学报，2003，5（3）：21 .
       ［4］  李红霞，许孟江.怀地黄多糖的含量测定［J］.河南科学，2002，20（2）：144.
       基金项目：吉首大学科研基金资助项目
       (吉首大学城乡资源与规划学院，湖南 张家界  427000)