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       【关键词】  花椒；,,天然免疫；,,抑制；,,小鼠
       摘要：目的为确定产自湖北省宜昌地区两品种花椒果皮是否会对机体的天然免疫功能产生影响而进行此实验。方法将花椒果皮醇提取物注射入小鼠腹腔内，确定药物的毒性并观察其对小鼠天然免疫功能的影响。结果宜都花椒的毒性明显强于五峰花椒；花椒提取物可明显降低腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吸附及吞噬能力，长期给药可使动物血液白细胞总数及淋巴细胞百分比显著下降。结论产自宜昌地区两品种花椒的毒性强度有明显差异，它们的提取物均可对小鼠的天然免疫功能产生抑制性影响。
       关键词：花椒；  天然免疫；  抑制；  小鼠
       Effects of the Seed Capsule Methanol Extracts of Zanthoxylum Species Cultured in Yichang Region on the Function of Mouse Natural Immunity
       XIAO Changyi, ZHOU Xingliang, CUI Qun
       （Department of Histo-Embrology, Medical College of Three Gorges University, Yichang 443002, China）
       Abstract:ObjectiveThe study was carried out to determine whether the methanol extracts of seed capsules of 2 Zanthoxylum species cultured in Yichang had the effect on function of mouse natural immunity in vivo. MethodsAfter the methanol extracts were injected into mouse peritoneal cavities, it was assayed for their toxicities to mice and their effects on chook RBC phagocytosis of mouse peritoneal macrophages. Injected for 22 days with extracts, the mice were taken the count of total and categories number of their WBC in blood and examined the structures of their thymuses and spleens. ResultsThe toxicity of Zanthoxylum obtained from Yidu was more intensive than that from Wufeng. Both methanol extracts of 2 Zanthoxylum species showed significant inhibition on adhesion capability and phagocytosis of mouse peritoneal macrophages to chook RBC. Many kinds of immune cells in the mouse peritoneal cavities had the morphological change of vacuole metamorphosis. Long-range administration of extracts could make the total number of WBC and ratio of lymphocytes in mouse blood lower significantly, but could not make the morphologies of mouse thymus and spleen structures change visibly.ConclusionThe toxicity intensity of the Zanthoxylum produced in Yidu is different from that in Wufeng. Both extracts of 2 Zanthoxylum species has the suppressive effects on the function of mouse natural immunity.
       Key words:Zanthoxylum;  Natural immunity;  Suppression;  Mouse
   
　　花椒为芸香科植物花椒的成熟果皮，品种较多。其性味辛、温，历代医家取其温肾暖脾、温通经脉之功，作为强身健体、益寿延年之品。近年来对花椒化学成分及药理作用已做了较为广泛的研究，然而其对机体免疫功能影响方面的研究并不多见［1~6］。此外，国内花椒品种类型较多，不同品种、或同一品种不同地域的花椒，在功效上也可能会有所不同。为此，笔者对产自湖北宜昌地区两花椒品种对机体天然免疫功能的影响进行了初步研究。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  花椒及提取200306分别采于湖北省宜昌地区的五峰县（W）和宜都市（Y），经我们根据《中国植物志》内所载芸香科各品种的花椒的枝、叶及果实进行比对，确定分属不同品种。采自五峰的花椒为一种与雷波花椒Zanthoxylum leiboicum近似的本地特有品种；采自宜都的花椒为花椒种Zanthoxylum bungeanum［7］。取五峰花椒与宜都花椒各100 g，用甲醇提取3次，过滤，旋转蒸发，浓缩挥发成浸膏，冰箱内保存，临用前先以吐温80溶解稀释成一定浓度的溶液，再用生理盐水稀释成所需浓度。
       1.1.2  5％鸡红细胞取新鲜公鸡血用阿氏抗凝剂抗凝，洗涤，离心，沉淀配成5％鸡红细胞悬浮液备用。
       1.1.3  动物雌性昆明种小鼠，体重20 g左右，由本校动物室提供。
       1.2  提取物安全剂量的确定
       1.2.1  首次注射剂量的确定按每60 kg体重（人）8 g生药（花椒），据经验公式计算，（8×10－3/60）×9＝0.001 2，再根据公式：0.001 2×m/A＝0.1～0.5 ml，其中m代表小鼠的重量，A代表药物的浓度。按20 g（m）小鼠体重注射0.3 ml，得A＝0.08 g/ml。即每毫升应含生药0.08 g。
       1.2.2  安全剂量的确定每种样品取4只小鼠，作好标记并称重后，按上法确定的量以0.3  ml/20 g体重进行腹腔注射。注射后观察小鼠的行为体征并作记录。若有死亡，则稀释10倍后，另取4只小鼠再行注射，直至注射后全部存活，并没有明显反应的情况出现，在此基础上，再稀释10倍的浓度作为安全剂量。
       1.3  花椒提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响30只小鼠随机分为3组进行药物的腹腔注射：五峰组按2 g（生药量）/kg的剂量注射五峰花椒提取物，宜都组按0.12 g/kg的剂量注射宜都花椒提取物，盐水组每只动物注射0.2 ml的生理盐水。1 h后，动物按0.5 ml的剂量腹腔注射5％的鸡红细胞。于注射后的第6小时取腹腔液，先滴腹腔液两滴于干净的载玻片上，置湿盒孵育30 min后，用吉姆萨－瑞氏复合染液染色，用于光镜观察。余下的腹腔液离心，2.5%戊二醛固定，制作电镜标本，用于电镜观察。
       1.4  花椒提取物对小鼠血液白细胞及免疫器官的影响将40只昆明种雌性小鼠随机分为4组，每组10只，即生理盐水组、地塞米松组、五峰组和宜都组。各组动物做腹腔注射1次/d，共22 d。其中生理盐水组注射剂量为0.2 ml，地塞米松组按2 mg/kg的剂量注射地塞米松，五峰组按2 g/kg剂量给药，宜都组按0.12 g/kg剂量给药。于末次注射后尾静脉取血涂片，吉姆萨－瑞氏复合染液染色，用Leica Qwin 550图像分析系统取图、计数白细胞总数及分类计数。取图时尽可能选择细胞密度大，但分散好的区域，每只动物每张血涂片取10张图。尾静脉取血后脱颈处死动物，取胸腺和脾脏做组织切片光镜观察。
       　　2  结果
       2.1  花椒提取物的形状比较总提出量五峰为11.96 g，宜都为20.4 g。五峰花椒提取物浸膏相对较稀，流动性较好，呈蓝黑色，比较容易用DMSO溶解稀释，溶解稀释后呈较为均匀的溶液。宜都花椒提取物浸膏相对较黏稠，呈黄褐色，以DMSO溶解，需较多溶剂，溶解后呈乳状悬液，静置后容易分层，出现絮状沉淀。
       2.2  提取物安全剂量的确定通过对小鼠两品种花椒提取物不同剂量注射的结果的比较可以看出，宜都花椒提取物的毒性明显大于五峰。结果见表1。
       表1  提取物安全剂量的确定（略）
       按全剂量：五峰花椒0.002，宜都花椒0.000 12
       2.3  花椒提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
       2.3.1  光镜观察对照组镜下可见多量吞噬细胞，细胞大小不等，吞噬鸡红细胞数量不等；一定数量的淋巴细胞、中性粒细胞及未被吞噬的鸡红细胞存在；未被吞噬的鸡红细胞量多吸附于吞噬细胞；各类细胞结构清晰（见图1）。五峰组及宜都组镜下仅见少量的吞噬细胞，大小不等，未被吞噬的游离鸡红细胞多，涂片内可见多量染色浅淡、结构不清的细胞，这些细胞的类型及性质难以判定。见图2~3。
       图1  对照组（略）
       图2  五峰组（略）
       图3  宜都组（略）
       对照组镜下可见多量吞噬细胞细胞大小不等，吞噬鸡红细胞数量不等；一定数量的淋巴细胞、中性粒细胞及未被吞噬的鸡红细胞存在；未被吞噬的鸡红细胞量多吸附于吞噬细胞；各类细胞结构清晰。五峰组镜下仅见少量的吞噬细胞，大小不等；未被吞噬的游离鸡红细胞多；同时还可见多量结构不清、类型难以判定的细胞。宜都组镜下可见一定数量的吞噬细胞，大小不等；未被吞噬的游离鸡红细胞多；同时还可见多量结构不清，类型难以判定的细胞。
       2.3.2  电镜观察对照组吞噬细胞数量多，吞噬的鸡红细胞多，细胞体积大，胞体周围吸附有多量鸡红细胞，吞噬细胞可发出多个突起，包绕所吸附的鸡红细胞。镜下还可见淋巴细胞及中性粒细胞。镜下各类细胞结构清晰。五峰组镜下未被吞噬的鸡红细胞多，仅见少量的吞噬细胞，大小不等，吞噬的鸡红细胞量少。部分吞噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞肿胀，细胞器结构模糊，胞质呈空泡样变化。宜都组镜下所见与五峰组类似。
       2.4  花椒提取物长期给药对小鼠血液白细胞总数及分类计数的影响两花椒组可使动物血液白细胞总数明显下降，虽下降作用不如地塞米松，但其对淋巴细胞百分比的下降作用明显要强，说明其降低百细胞总数的作用主要是使淋巴细胞数减少。结果见表2。
       表2  不同组动物间血液白细胞总数及分类计数的比较（略）
       与对照组比较有显著性差异，★P<0.01；与地塞米松组比较有显著性差异，▲P<0.01；与五峰组比较有显著差异，P<0.01；n=10
       2.5  花椒提取物长期给药对小鼠免疫器官的影响
       2.5.1  不同组动物脾重量的比较仅地塞米松组小鼠脾脏重量明显下降。五峰组动物脾脏重量虽有一定程度的下降，但还没有达到显著的水平，这主要是因为组内动物脾脏重量之间的差异太大所致。宜都组动物脾脏重量与对照组相比无显著性差异。结果见表3。
       表3  不同组动物动物脾脏重量比较（略）
       与其它各组比较有显著差异，★P<0.01
       2.5.2  动物胸腺和脾脏组织切片的光镜观察对动物胸腺组织进行观察，除地塞米松组动物胸腺皮质较对照组略有变薄、髓质区域有所扩大外，两花椒组动物的胸腺组织与对照组相比无明显差异。比较各组动物脾脏的组织结构，地塞米松组脾脏显示有较明显的萎缩，两花椒组动物脾脏与对照组相比未见明显差异。
       　　3  讨论
       花椒属Zanthoxylum Linn植物属芸香科（Rutaceae），全世界约250种，我国约有45种，尤以长江南及西南诸省最多。有关本属植物化学及药理学研究已有诸多报道。数种花椒的果实、根、茎和叶皆可入药。花椒性温、味辛，有毒，入脾、肺、肾经，常用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹痛，蛔虫症；外治湿疹瘙痒。据文献记载［7］，我国花椒属药物约有20种，有关其生物活性成分和药理学等方面的研究，国内外都有诸多报道。但绝大多数仅限于观察性的和经验性的研究，缺少系统性和权威性。从既往的研究来看，其药理研究和临床应用大致有以下几个方面：镇痛、镇静、降压的作用，平喘作用，抗菌及抗癌、抗氧化作用，对肠平滑肌的解痉作用［1~4］,同时还具有一定的抗炎作用［5,6］。纵观以前国内学者对本属植物药用方面的研究，大多涉及不深，尤其是免疫功能影响方面的报道极少发现，因此对花椒还有很大的研究空间和研究价值。根据既往花椒在治疗荨麻疹方面的应用［8］，抗炎［5］和对腹腔巨噬细胞的毒性作用［6］，提示花椒可能具有调理机体免疫反应的功能。为此，我们分别对小鼠进行了给药后急慢性非特异性免疫功能的检测。花椒提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的检测结果提示，花椒提取物对小鼠腹腔巨噬的细胞吞噬功能是有抑制作用的，这种抑制作用可能是细胞毒性的，使吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬及吸附能力降低，并使小鼠腹腔内其它免疫细胞出现变性性的变化，在光镜下表现为细胞结构模糊，着色浅淡，细胞类型难以判定。电镜下部分吞噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞肿胀，细胞器结构模糊，胞质呈空泡样变化。实验表明，花椒提取物对腹腔内的多种免疫细胞具有毒性作用，这种毒性作用可能是非特异性的。长期给药，可使小鼠血液之中的白细胞总数明显下降，尽管在白细胞总数下降的幅度上，花椒提取物的作用比不上地塞米松，但对淋巴细胞的降低程度上，两花椒提取物的作用明显强于地塞米松，而五峰花椒又强于宜都花椒。这一结果说明，花椒提取物中含有免疫细胞毒性的物质，而且主要特异性地作用于淋巴细胞系。因为对两花椒组动物胸腺及脾脏进行观察，未见明显的组织学改变，故花椒提取物致使小鼠血液淋巴细胞降低的具体作用部位还有待进一步研究确定。为确定本地两种花椒的药理活性是否有所不同，本研究特选择分别产自宜昌地区五峰和宜都两品种的花椒进行了比对。通过对小鼠两品种花椒提取物不同安全剂量确定的结果比较，可以看出，宜都花椒提取物的毒性明显大于五峰，其安全剂量的差异约为1∶10～16。这一结果说明，产自宜昌地区的这两种花椒的药理活性确有差异。对两种花椒提取物的提取量、颜色、形状和溶解性质的比较，也可以看出，两不同产地的花椒是有着明显差异的。这与刘雄早先对4种花椒的研究结果是类似的［7］，刘雄的研究结果曾证实，花椒可因品种与产地的不同，其化学成分在组成及含量上均有较大差异。本研究所用两品种花椒在具体化学成分上的差异，还有待今后进一步的研究分析。
       　　参考文献：
       ［1］  孙小文，段志兴.花椒属药用植物研究进展［J］.药学学报，1996,31(3):231.
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       ［3］  杨纯瑜.中国花椒属的药用植物［J］.中草药，1992,23(1):45.
       ［4］  王本祥.现代中药药理学［M］.天津：天津科学技术出版社，1997：613.
       ［5］  Tezuka Y, Irikawa S, Kadota S, et al. Screening of Chinese herbal drug extracts for inhibitory activity on nitric oxide production and identification of an active compound of Zanthoxylum bungeanum［J］.Journal of Ethnopharmacology, 2001, 77(2):209.
       ［6］  Matu EN, Staden J. Antibacterial and anti-inflammatory activities of some plants used for medicinal purposes in Kenya［J］.Journal of Ethnopharmacology, 2003,87(1):35.
       ［7］  中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第43卷第2分册［M］.北京：科学出版社，1997：13.
       ［8］  刘炳书.花椒水治疗荨麻疹［J］.中国民间疗法，2002,10(5):25.
       基金项目：湖北省宜昌市科技局资助项目（宜科发［2004］17号A04401-9）
       (三峡大学医学院，湖北  宜昌  443002)