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       【关键词】  黄连解毒汤；,,配方颗粒；,,提取定量
       摘要：目的优选黄连解毒汤栀子苷、盐酸小檗碱和黄芩苷3种成分的提取方法，对该方配方颗粒组方汤剂与传统汤剂所含3种成分定量，并比较两种汤剂3种成分的提取率。方法考察不同溶剂、不同提取时间及溶剂用量改变对栀子苷、盐酸小檗碱和黄芩苷提取含量影响，采用高效液相色谱法测定。结果提取条件为250 倍量75%乙醇超声处理15 min即可同时有效提取复方中3种成分。配方颗粒组方汤剂栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷平均提取率依次约为传统汤剂相应成分平均提取率的70%，145%及123% 。结论优选得到的提取方法简便易行，稳定性好。测定结果可客观反应该方两种汤剂3种成分提取率。
       关键词：黄连解毒汤；  配方颗粒；  提取定量
       Extraction and Determination of Three Components in Huanglianjiedu Decoction
       CAO Peixue, LIANG Guangyi
       （The Key Laboratory of Chemistry of Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences， Guiyang , Guizhou  550002, China; Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang , Guizhou  550002, China）
       Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process of geniposide, berberine hydrochloride and baicalin in Huanglianjiedu Decoction, and analyze the  content and compare the extraction rate of three components between refine granule decoction and traditional decoction.MethodsHPLC method was used for researching the effect of different solutions, extraction time and solution volume fold on geniposide, berberine hydrochloride and baicalin. ResultsThe optimum extraction conditions were 250 fold of 75% ethanol, supersonic extraction 15 minutes. The extration rates of geniposide, berberine hydrochloride and baicalin in refine granule decoction were 70%, 145% and 123% of traditional decoction respectively. ConclusionThe optimized method is simple, stable and efficient. The determination results can reflect the extraction rates of three components objectively.
       Key words:Huanglianjiedu Decoction;  Refine granule;  Extraction and determination
   
　　黄连解毒汤出自唐代王焘所著《外台秘要》，主治一切实热火毒，三焦热盛之证。传统用法为加水煮取药液服用，由于此法临床运用不便，现代产生以单味药材提取制备成配方颗粒、按需配伍混合、沸水冲泡服用的方式。黄连解毒汤传统汤剂临床应用已有上千年，其功效历经年代考验得以公认，改变传统汤剂为配方颗粒沸水冲泡液（即配方颗粒汤剂）是否影响其内在成分含量，本文选取组方药材中具代表性的成分作为定量指标进行检测并比较。
       　　1  组方剂量及复方汤剂煎法考察
       1.1  古方剂量换算原方组成为黄连三两，黄柏二两，黄芩二两，栀子十四枚（擘）。据唐代与现今用药剂量换算［1］，唐代用药小两制计，一两约为今之13.8~14 g，组方各药用量即黄连42 g，黄柏28 g，黄芩28 g，栀子42 g，药量比近似为（3∶2∶2∶3）。
       1.2  煎煮方法古方煎法为“上四味切，以水六升，煮取二升”，即有四升水被蒸发，根据现代对水蒸发量实考［2］及唐代小制一升约合现代200 ml 计［1］，煎沸1 h 即可。由于方药为根茎、果实类，古方只煎1次，有相当多成分还未能提出，现代煎法多为浸泡后煎2~3次［3］。结合实验中考察本方药材平均吸水率196%（ml /g）（为方便计算，以200%计），由此确定黄连解毒汤煎提方法为：按上述“古方剂量换算”所得比例，取组方诸药混合得140 g，加水1 200 ml，浸泡1 h，煎煮保持微沸1 h ，趁热分出煎液，药渣再各加920 ml水依次煎沸45，30 min ，合并3次煎液，即得。
       　　2  材料与方法
       2.1  药材来源组方用药材购自本地济仁堂药店，由贵阳中医学院何顺志老师鉴定。见表1。
       表1  组方药材品种来源（略）
       2.2  样品制备
       2.2.1  传统汤剂干膏制备按“煎煮方法”项下确定的三煎法操作制备得黄连解毒汤传统复方汤剂，再减压浓缩干燥，适当粉碎，得传统汤剂干膏。
       2.2.2  配方颗粒汤剂干膏制备分别取单味药材，按传统复方汤剂制法用水比例加水同法浸泡、煎提、浓缩、干燥、粉碎，制备各单味药材配方颗粒，并计算干膏率。根据各单味药材干膏率换算（表2）并称取相当于传统汤剂组成药材用量的各单味药材配方颗粒，混匀，得配方颗粒汤剂干膏。
       表2  样品干膏率（略）
       2.3  提取方法考察栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱常作为相应药材栀子、黄芩、黄连和黄柏具代表性的定量成分［4］，故此本文以这3种成分作为2种复方汤剂定量考察指标，通过超声处理法提取，并以高效液相色谱法检测。
       2.3.1  不同提取溶剂考察取配方颗粒汤剂干膏适量，研细，精密称取0.2 g，置100 ml量瓶中，加入不同溶剂稍低于刻度，超声处理30 min，取出，冷却，以相应溶剂定容，摇匀，滤过，取续滤液测定。图1显示，溶剂变化对栀子苷含量影响较小，75 %乙醇作溶剂提取盐酸小檗碱和黄芩苷含量较高。
       图1  不同提取溶剂考察（略）
       2.3.2  溶剂用量考察75%乙醇作溶剂，检测溶剂用量（ml）与配方颗粒汤剂干膏（g）比约为100∶1，250∶1，500∶1时超声处理30 min 3种成分含量变化（图2），用量比100∶1样品液较浓，故确定250∶1较宜。
       图2  溶剂用量考察（略）
       2.3.3  提取时间考察75%乙醇作溶剂分别超声处理15，30，45，60 min，考察配方颗粒汤剂干膏栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷含量变化（图3），超声处理15 min即可。
       图3  超声处理时间考察（略）
       2.3.4  上述考察结果显示75%乙醇作溶剂，溶剂用量与称样量比250∶1，超声处理15 min即可同时有效提取复方中栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷。
       2.4  方法学考察
       2.4.1  仪器与试药HP1100型高效液相色谱仪（美国惠普）。KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）。原料药材来源、传统汤剂干膏及配方颗粒汤剂干膏制备同上。含量测定用对照品栀子苷（749－200108）、盐酸小檗碱（0713－9906）、黄芩苷（715－200010）均购于中国药品生物制品检定所，并经五氧化二磷减压干燥至恒重。甲醇、乙醇、磷酸、三乙胺，四氢呋喃（重蒸）均为分析纯，水为纯净水，乙腈为色谱纯。
       2.4.2  色谱条件选用相同分析柱Agilent Extend-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），不同流动相和检测波长对3种成分进行分离。具体条件见表3。
       表3  高效液相色谱分离条件（略）
       B相配制： 每100 ml 浓度为0.05%（g/ml）磷酸二氢钾水溶液（其中含体积浓度0.05%三乙胺），加入7 ml 四氢呋喃，再以磷酸调 pH至3
       2.4.3  标准曲线制备分别精密称取适量干燥对照品，以75 %乙醇配制得浓度为0.250 mg/ml栀子苷对照品溶液、0.650 mg/ml盐酸小檗碱对照品溶液及0.520 mg/ml黄芩苷对照品溶液。再分别稀释成6个不同浓度，不同浓度同种对照品溶液取同体积进样，按相应色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值（Y）对含量（X）作线性回归，回归方程见表4。
       表4  线性关系测定结果（略）
       2.4.4  精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6 次，栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积RSD分别为0.97%，0.83%，1.41% 。
       2.4.5  稳定性实验按“样品含量测定”项方法制备样品供试液，精密吸取同一瓶样品供试液，于20 h内分别进样，按相应色谱条件测定并计算栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷含量，各测6次，RSD 依次为1. 58 %，1. 42 %，1. 75 %。三成分稳定性良好。
       2.4.6  重复性实验取同一批配方颗粒汤剂干膏，按样品测定项方法处理，平行制备9份样品液，同法测定，用外标法计算栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷含量，平均值依次分别为4.00%（RSD＝3.05%），5.66 %（RSD＝1.30 %），5.07 %（RSD＝1.52%）。
       2.4.7  回收率实验精密称取已知含量的配方颗粒汤剂干膏0.1 g ，分别加入样品中对应成分含量80％，100％，120％的对照品，按“样品含量测定”项下方法处理，同法测定。平均回收率分别为：栀子苷99.60%，RSD1.91%；盐酸小檗碱101.66%，RSD2.11%；黄芩苷100.31%，RSD2.57%。
       2.4.8  样品含量测定取配方颗粒汤剂干膏适量，研细，精密称取0.2 g，置50 ml量瓶中，加入75 %乙醇约45 ml，超声处理15 min，取出，冷却，75 %乙醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，分别按相应色谱条件测定栀子苷、盐酸小檗碱及黄芩苷（表5）。配方颗粒组方汤剂栀子苷、盐酸小檗碱、黄芩苷平均提取率依次约为传统汤剂相应成分平均提取率的70%，145%及123%。
       2.4.9  水液及75 %乙醇提取液含量比较取黄连解毒汤传统汤剂水煎液上清液及配方颗粒组方汤剂沸水冲泡液上清液检测，并与上法75 %乙醇提取液比较（表6），上清液所含盐酸小檗碱和黄芩苷明显低于醇提液。由于水煎汤剂及沸水冲泡液含大量沉淀，此两种成分有大部分存在于沉淀中，水液检测结果未能反应沉淀部分两种成分含量。
       表5  黄连解毒汤样品含量测定（以传统复方药材计）（略）
       △提取率是与相同投料量复方药材相应成分含量比较计算而得；n=3
       表6  黄连解毒汤水液与醇提液样品含量比较（略）
       n=3
       3  讨论
       3.1  考虑到配方颗粒汤剂未经过混合加热煎煮过程，故其定量成分的提取不采用加热回流、索氏提取等需加热的方法处理，而选用超声处理法提取。
       3.2  本实验水液（上清液）检测结果并未真实反应汤剂相关检测成分含量，且水提物稳定性较差，因此在比较多种溶剂提取影响后选用75 %乙醇作为适宜的提取溶剂。
       3.3  多成分共存及助溶作用能增加中药复方汤剂各成分在水中的煎出量，但水溶性较差或相互作用可产生沉淀的成分煎出后却又不能完全溶解于水中。为能客观反应汤剂内在质量，不可忽视沉淀部分的研究。
       　　参考文献：
       ［1］  李具双.汉唐时期药用衡制及量值考［J］.北京中医药大学学报，2004，27（2）：15.
       ［2］  陶汉华.经方药量换算与考证［J］.山东中医药大学学报，1997，21（4）：307.
       ［3］  马宏伟，潘  娜.影响汤剂煎煮质量的因素分析［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11（10）：785.
       ［4］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：173，213，214.
       基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.30460154)
       (贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳  550002；贵阳中医学院，贵州 贵阳  550002)