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       【关键词】  正交设计；,,黄芩；,,酶解；,,黄芩苷
       摘要：目的以黄芩苷为指标，优化黄芩酶解提取的最佳工艺条件。方法运用正交设计筛选酶解参数。以高效液相色谱法测定黄芩苷，并计算其收率。结果当复合酶用量为底物的1％，保温沉淀时间1.5 h，提取温度50℃，提取时间2 h时，黄芩苷收率达17.2%。结论 在优化的酶解条件下，黄芩苷的收率最高。该研究为黄芩苷提取物的制备提供了一种新方法。
       关键词：正交设计；  黄芩；  酶解；  黄芩苷
       The Optimum Extraction Technology of Baicalin from Radix Scutellaria by Enzymatic Hydrolysis
       WU Fengqi,LI  Lei *,WANG Zhiren
       （1st Inst.of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China； Qingdao Weilun Biotechnological Co.Ltd., Qingdao 266061,China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of baicalin from Scutellaria baicalensis on the condition of enzymatic hydrolysis.MethodsTo optimize by the orthogonal design，and to determine the content of baicalin by HPLC.ResultsThe optimum extraction condition was obtained as follows: the ratio of enzyme/substrate was 1%, the time of enzymatic hydrolysis was 2h at the extraction temperature of 50℃, and kept at 80℃ for  1.5h after adjusting the pH value to 2.0. ConclusionThe new method is developed for preparing the baicalin extract.
       Key words：Orthogonal design;  Scutellaria baicalensis Geo.;  Enzymatic hydrolysis;  Baicalin
   
　　黄芩为唇形科植物Scutellaria baicalensis Geo.的干燥根，性寒味苦，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。黄芩苷(baicalin)是黄芩中的主要有效成分。现代药理研究表明：黄芩苷具有清热解毒、抗炎利胆、保肝、抗氧化和抗肿瘤等功能，在临床上被广泛应用［1］。中药材有效成分往往被包裹在细胞壁内，在药用植物有效成分提取过程中，选用适当的酶作用于药用植物材料，可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质降解，破坏细胞壁的致密构造，减小细胞壁和细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效成分的溶出［2］。目前，黄芩苷的提取工艺多以水提为主，运用生物酶解进行提取的报道不多。为寻找酶解提取最佳工艺、提高黄芩苷的产率和纯度、减轻后处理的负担，本文运用正交设计全面考察了酶用量、提取时间和温度、保温沉淀时间等因素及其交互作用对黄芩苷收率的影响。
       　　1  材料与方法
       1.1  仪器美国安捷伦公司Agilent 1100型高效液相色谱仪(包括四元泵,真空脱气机,自动进样器,柱温箱DAD检测器) , Agilent 1100化学工作站；上海安亭科学仪器厂Anke LXJ-ⅡB型离心机；上海跃进医学仪器厂数显式恒温水浴锅。
       1.2  药材及试剂提取用复合酶（内含纤维素酶136万u/ml，半纤维素酶15万u/ml，果胶酶160万u/ml，β-葡萄糖酶0.8万u/ml）为宁夏和氏璧生物有限公司生产；黄芩苷对照品(自制，HPLC归一化法计算其含量大于98%)；生药黄芩的干燥根(产地为青岛胶南黄芩GAP产业基地)，经青岛市炜伦生物技术有限公司汪志仁药师鉴定为唇形科植物Scutellariabaicalensis Geo.的干燥根。甲醇为色谱纯，水为超纯水，醋酸为分析纯。
       1.3  方法
       1.3.1  黄芩药材前处理由于黄芩中黄芩苷酶的存在，提取前若未先除酶，湿润下的黄芩粉在32℃恒温5 h，则黄芩苷完全酶解，形成很不稳定的邻三羟基黄酮，极易氧化变成绿色醌类衍生物，影响黄芩苷含量的提取［3］。本实验采用的复合酶最佳提取温度为25～55℃。为此，在进行实验前宜先将黄芩原药材粉碎，通过热蒸气加热30 min,以便“杀酶保苷”，避免原料中黄芩苷酶对黄芩苷提取的影响。
       1.3.2  黄芩酶解工艺步骤将黄芩药材粉碎后，通过热蒸气加热30 min灭酶，再加入10倍水和适量的复合酶，按表1和表2设计的技术参数提取。将提取液转移至离心杯中，5 000 r/min离心15 min，取上清液，加盐酸调pH值为2，在80℃保温，使黄芩苷析出。过滤，沉淀物用水洗至pH=5.0,冻干，即得黄芩苷粗提物。
       1.3.3  正交实验设计方案［4］因素水平见表1。
       表1  黄芩酶解工艺因素水平（略）
       1.4  黄芩苷含量测定［5］
       1.4.1  色谱条件  色谱柱 BECKMAN C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇∶水∶醋酸＝47∶53∶0.2；流速1.0 ml/min，检测波长280 nm，进样量10 μl。
       1.4.2  标准曲线的制备精密称取黄芩苷标准品5 mg，于25 ml容量瓶中加甲醇溶解、定容。再分别取2，4，5，6，8 ml置于10 ml容量瓶加甲醇至刻度。分别取10 μl，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程及线性范围为：Y=3×106X+1 517.4（r=0.999 3）。
       　2  结果
       正交实验结果见表2。由表2可以看出，影响黄芩苷收率的因素依次为：D>A>C>B（极值R的排列顺序）。黄芩苷最佳酶解工艺为表2中的第2号实验：A1B2C2D2 ，即酶用量为底物的1％，加热提取温度50℃，提取时间2 h，保温沉淀时间1.5 h时，可得到最大的黄芩苷收率（17.2％）。
       表2  酶解黄芩工作安排表（略）
       黄芩苷收率（%）=100（黄芩粗提取物的质量×黄芩粗提物中黄芩苷百分含量）/黄芩提取前质量
       　　3  讨论
       本文针对酶解工艺在黄芩提取的实际应用中运用较少、工艺不成熟的现状，将酶解工艺引入到黄芩的提取中，应用含有多种酶的复合酶，充分发挥酶解优势，对黄芩的酶解提取进行了研究。运用正交实验确定了黄芩苷最佳酶解工艺。为黄芩酶解工艺的中试放大提供了一定的参考依据，但由于投料量较少，在实际生产中还有待验证。此外，由于黄芩自身的酶解，第1步采用蒸气加热以“杀酶保苷”是必要的。在提取中本文没有进行二次提取，主要是考虑到在实际生产中一般均不采用二次提取，同时也是为了便于酸沉淀、抽滤、洗酸等工艺过程。因为洗酸过程要反复进行3～4次，本方法可以缩短生产周期和减少酸的用量，提高酶解工艺的实用性。黄芩苷Ｃ2上的羟基易成盐，在酸性条件下黄芩苷分子就被还原出来，但这种反应要求的反应温度较高，若在低温条件下非常缓慢。因而黄芩苷滤液加酸后，80℃保温是非常重要的条件，直接其影响收率［6］。考虑到在实际工业生产中的可操作性，保温时间不宜过长，为此本文尝试选取保温时间1～2 h。结果表明1.5 h为最佳。在最后一步的水洗调pH时，可选择水洗或醇洗。从经济角度来说，水洗较佳。
       　　参考文献：
       ［1］  刘青云.中药药理学［M］.北京：人民卫生出版社，1997：41.
       ［2］  梅景良. 高效液相色谱法在黄连解毒药剂质量检测上的应用［J］.福建畜牧兽医，2005，27（1）:21.
       ［3］  余洪波,张晓昱. 酶法在中药提取中的研究进展［J］.中成药，2005,27（5）：591.
       ［4］  杨中林，卢凤兰. 正交实验设计筛选酒炙黄芩的最佳条件［J］.中药材，1996,19（9）：453.
       ［5］  刘  源,邓少伟,原文鹏,等. RP-HPLC法测定黄芩中3种黄酮［J］.中草药，2005,36（8）：1247.
       ［6］  巩喜姣,薛志宏,何  刚. 黄芩苷生产工艺研究［J］.中医药学报，2000，28（3）：47.
       基金项目：国家星火计划项目资助（No.2004EA741032）
       (国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛  266061；青岛炜伦生物技术有限公司，山东 青岛  266061)