牛膝种子带菌检测和药剂消毒处理效果研究
作者：淡红梅， 李静 ，李
《时珍国医国药》 2007年 第1期
多个检索词，请用空格间隔。
【关键词】 牛膝种子；,,寄藏真菌检测,；,,药剂消毒
摘要：目的研究3个不同产地的牛膝种子寄藏真菌情况，比较不同药剂处理牛膝种子的消毒效果，为牛膝种子预防保健处理提供依据。方法采用离体平皿法对牛膝种子表面和内部进行带菌检测；通过平皿培养法观察药剂拌种的消毒效果。结果牛膝种子表面的孢子负荷量为17.8孢子/粒种子～321.9孢子/粒种子，产地间差异极显著；携带的优势真菌群主要为青霉属Penicillium spp.，曲霉属Aspergillus spp.真菌，产地间差异不显著，但分离频率差异显著；种子颖壳带菌率在19.5%～67.3%,种仁的带菌率在13.5%～47.5%, 内部寄藏的优势菌群主要有铰链孢属Alternaria spp.，根霉属Rhizopus spp.，曲霉属和交链孢属真菌，产地间带菌率和优势菌群都有较大差异。结论 在7种农作物常用的种子处理消毒剂中敌克松表面消毒效果相对较好，可达到50.0％以上。
关键词：牛膝种子； 寄藏真菌检测 ； 药剂消毒
Testing of Seed-borne Fungi of Achyranthes Seed and Disinfection Effect of Seven Fungicides on Seed-borne Fungi
DAN Hong mei, LI Jing, LI Xi, LI Xian en, LI Jian qiang
(China Union Medical College,Instisute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100094,China; Biological and Technological College, China Agricultural University, Beijing 100094,China)
Abstract：ObjectiveTo study the dominant seed_ borne fungi of Achyranthes seeds from 3 different producing areas and compare the disinfection effect of several fungicides on seed-borne fungi of Achyranthes seed. MethodsPetri-dish testing was used to determine the external and internal seed-borne fungi and the disinfection effect of fungicides.ResultsThe result showed that the amount of spore on the surface of one Achyranthes seed was17.8%～321.9% according to different samples, and the big differences existed. Penicillium spp.and Aspergillus spp. were the two kinds of externally dominant fungi and there was few differences in fungi kind among producing areas but differences in fungi isolation frequency; Penicillium spp. ,Rhizopus spp., Aspergillus spp. and Alternaria spp. were the internally dominant seed-borne fungi ,including seed capsule and the internal tissue of seed and their fungi percentage was 19.5%～67.3% and 13.5%～47.5% respectively. There were differences in fungi percentage and dominant seed borne fungi among different producing areas. ConclusionThe disinfection effect of seven fungicides are not so good, only Fenaminosulf was up to 50.0%.
Key words：Achyranthes Seed; Seed-borne Fungi Testing; Effect of Fungicide
随着人们对种子质量的认识提高，不再局限于传统的净度、发芽率、水份和千粒重，而越来越关注种子健康状况和通过对种子健康保健处理来提高种子播种价值。国内外对很多大田作物如小麦、水稻、玉米等种子都进行了健康检测的研究［1～5］，并且检验技术已经日趋成熟，但是关于中药材种子健康检测还少有报道。怀牛膝(Achyranthes Bidentata B1.)为苋科多年生草本植物，以根入药，有补肝肾、强筋骨、逐淤通经、引血下行之功效［6］。牛膝以种子繁殖，我国许多省份都有大范围的人工种植，近年来随着牛膝种植面积逐渐增大,牛膝种子在产区间频繁调运。但目前还没有关于牛膝种子健康检测和种子药剂消毒处理的相关文献报道。本试验参考国际种子检验规程和农作物种子健康检测方法,对来自3个不同产地的牛膝种子进行寄藏真菌检测，同时选用农作物种子常用的7种杀菌剂进行种子消毒处理，旨在明确牛膝种子内、外所携带的优势菌群并筛选合适的种子处理药剂，为牛膝种子产区间安全调运和实施种子预防保健处理防治牛膝种子真菌病害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试样品 2005年收集的当年产牛膝种子共3份，分别来自河南温县，河南武陟，北京中国医学科学院药用植物研究所。
1.2 供试杀菌剂 50%福美双（thriam）WP，50%多菌灵（carbendazim）WP，70%土菌消（hymexazol）WP，70%代森锰锌（mancozeb）WP，70%敌克松（fenaminosulf）WP，20%萎锈灵胶悬剂（carboxin）FS，35%阿普隆拌种剂（mentality）ES，均由中国农业大学种衣剂研究发展中心提供。
1.3 方法牛膝种子带菌检测：参照《ISTA Handbook on Seed Health Testing》和《植病研究方法》等书中有关的方法［7～9］。
1.3.1 种子外部带菌检测 每份样品随机选取400粒种子，放入100 ml锥形瓶中，加入50 ml无菌水充分振荡，吸取悬浮液1 ml，以2000 r・min-1转速离心10 min，弃上清液，再加入1 ml无菌水充分震荡、浮载后吸取100 μl加到直径为9 cm的 PDA平板上，涂匀，每个处理4次重复。相同操作条件下设无菌水空白对照，25℃温箱中黑暗条件下培养5 d后观察，统计种子外部带菌种类及其分离比例,计算孢子负荷量。
孢子负荷量（孢子数/粒种子）=分离孢子总数 检测种子总数
1.3.2 种子内部带菌检测 将牛膝种子的颖壳与籽粒分开，用5%NaClO溶液浸泡颖壳5 min，籽粒2 min，无菌水冲洗3遍，将同一样本的颖壳和籽粒分别均匀摆放在直径为15 cm的PDA平板上，每皿摆放100粒，4次重复。25℃恒温、黑暗条件下培养5～7 d，统计真菌种类、分离频率和带菌率。
1.4 种子带菌鉴定将分离到真菌分别进行纯化、镜检和转管保存。根据真菌培养性状和形态特征，参考工具书进行鉴定。
1.5 药剂消毒处理效果检测 按照杀菌剂处理种子安全有效剂量选择原则，对供试种子进行药剂消毒处理：50%福美双WP按药剂种子质量比1∶125拌种；50%多菌灵WP和35%阿普隆拌种剂按药种比1∶333拌种；70%土菌消WP按药种比1∶182拌种；70%代森锰锌WP按药种比1∶200湿拌；70%敌克松WP按药种比1∶118拌种；20%萎锈灵胶悬剂按药种比1∶72拌种，以未经任何药剂处理的种子作为对照。经过处理的种子均匀摆放在直径为15 cm的PDA平板上，每皿100粒，4次重复，25℃，12 h光照/黑暗交替条件下培养，3～7 d后观察记录。
药剂消毒处理效果（%）=对照样品带菌率―药剂处理样品带菌率 对照样品带菌率×100%
2 结果
2.1 种子外部带菌检测不同产地牛膝种子外部携带的真菌情况差异较大（见表1）。河南温县和武陟种子样本孢子负荷量高，分别为321.94孢子/粒种子和168.13孢子/粒种子，种子表面携带的优势真菌群主要为青霉属真菌。北京药用植物研究所牛膝种子外部孢子负荷量较低，为17.81孢子/粒种子，优势菌群为青霉属，曲霉属和交链孢属真菌，3个产地种子外部携带真菌孢子量差异大，分析其原因，可能与田间生态、卫生洁净程度、采收和储运管理等有关。
2.2 种子内部带菌检测根据表2和表3带菌统计显示,不同种子内部所带真菌种类差异不明显，颖壳和籽粒携带的优势菌群均为交链孢属、青霉属和根霉属真菌。来自北京药用植物研究所牛膝种子颖壳和籽粒的带菌率均小于河南温县和武陟的带菌率，分别只有19.50%和13.50%。在河南武陟牛膝种子上分离到镰孢属真菌。
表1 牛膝外部携带真菌种类和分离比例（略）
“―”表示未分离到真菌
表2 牛膝种子内部（颖壳）携带真菌种类和分离比例（略）
“―”表示未分离到真菌
表3 牛膝种子内部（籽粒）携带真菌种类和分离比例（略）
“―”表示未分离到真菌
表4 药剂对牛膝种子的消毒效果（略）
“―”表示没有消毒效果
2.3 药剂对种子的消毒效果 根据表4可以得出，7种药剂用于牛膝种子消毒处理效果不理想。只有敌克松对3份样品同时有一定的消毒效果，却不超过70％。而其余几种药剂对温县和武陟的样品几乎都没有消毒作用。药剂对药植所的样品都有一定的消毒效果，其中福美双、土菌消和代森锰锌的消毒效果超过了80％，可以看出药剂对不同产地种子的消毒效果呈现很大的差异。
3 讨论
3.1 从3个不同产地种子样本外部总体带菌情况来看，牛膝种子外部主要携带的优势菌群为青霉属真菌，趋于一致，而孢子负荷量差异很大，河南武陟和温县携带的孢子量远高于药植所种子孢子量，形成带菌量差异可能因为：河南温县和武陟作为牛膝的道地产区已经有上百年的历史了,北京药植所试验地是牛膝新种植区,有可能是由于道地产区种植牛膝的时间长, 在地里累积的菌落逐年增多，从而散布在农田里的孢子或菌丝体等真菌繁殖体在收获种子的时候很容易附集在种子表面；从河南收集的种子样本分别从农户那里获得，农户对种子储存具有随意性，而不严格的种子储存条件很容易染上真菌，并且利于其繁殖和生长；而试验地收获的种子在晾干后便置于在4℃条件下保存，这样的储存条件抑制了真菌的繁殖和生长。
3.2 3个不同产地种子样本内部携带真菌种类较稳定，差异不明显，颖壳和籽粒携带的优势菌群均为交链孢属、青霉属和根霉属。从3种菌的带菌量来看，药植所样本颖壳和籽粒的带菌率均小于温县和武陟的带菌率，也可能是因为新旧产区和储存条件的差异引起的。
3.3 常用于农作物种子保健处理的7种药剂用来处理牛膝种子,消毒作用不理想。对药植所种子样本有一定的消毒效果，但对武陟和温县种子样本几乎没有太大的作用。消毒效果在不同种子样本中出现差异可能是由于温县和武陟两份种子样本表面都携带大量的青霉，而这几种药剂对青霉的抑制作用较弱；有药剂的用量不够。
3.4 从整体看来，牛膝种子内外带菌率都较高，但是从大量的发芽试验中观察到种子在发芽期间很少出现霉烂和种苗带菌情况。可能是由于自身携带的青霉属真菌量较大,青霉属真菌有利于抑制其它菌落的生长；牛膝种子自身的活力较强，发芽期间代谢旺盛，自身对各种病菌有一定的抑制作用。
3.5 牛膝播种时间一般在6月下旬和7月上旬, 苗期正值降水量大的时期,很容易染上根腐病,猝倒。牛膝种子内部携带的主要是铰链孢属和根霉属真菌,这些真菌孢子在累计到一定程度时,容易引起病害。是否牛膝苗期病害的发生和牛膝种子携带的真菌种类和带菌量有一定相关性,需要进一步实验的验证。
参考文献：
［1］ 李健强，刘西莉，王 锋，等.小麦黑胚病种子带菌的光镜和扫描电镜观察［J］.表示没有消毒效果植物病理学报,1999,29(1)：22.
［2］ 刘西莉,李健强,朱春雨,等.不同水稻品种种子带菌检测及药剂消毒处理效果［J］.中国农业大学学报, 2000,5(5):42.
［3］ 李健强,刘西莉,朱春雨,等.云南省玉米种子带菌检测及种衣剂处理的生物学效应［J］.云南农业大学学报,2001,16(1)：5.
［4］ 吴学宏,刘西莉,刘鹏飞,等.西瓜种子带菌检测及杀菌剂消毒处理效果［J］.农药学学报,2003,5(3)：39.
［5］ 国际种子检验协会,International Rules for Seed Testing［M］.北京：中国农业出版社,1996,173.
［6］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部 ［S］.北京：化学工业出版社,2005：49.
［7］ Agarwal,V.K. Principles of Seed Pathology_2nd ed; USA,Lewis Publishers,1996：341.
［8］ 方仲达.植病研究方法，第3版［M］.北京：中国农业出版社,1998：159.
［9］ 魏景超. 真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979（9）：405，463.
基金项目：国家科技攻关计划资助项目（No.2001BA701A59）
（中国协和医科大学・中国医学科学院药用植物研究所，北京 100094；中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094）