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       【关键词】  山东产丹参；,,遗传多样性；,,扩增片段长度多态性技术
       摘要：目的研究山东产丹参的遗传多样性，初步探讨扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记技术在丹参道地性鉴别上的应用。方法采用扩增片段长度多态性（AFLP）技术对山东产15个丹参样本进行DNA多态性分析。结果利用4对引物组合构建了15个丹参样本的DNA指纹图谱，通过相似性和聚类结果分析，丹参和白花丹参样本的遗传相似性较低，聚类结果也划分为两大类群，证明它们之间的亲缘关系较远，分化明显。临沂地区的野生和栽培丹参样本聚在一类，且栽培品种和野生品种之间具有一定的遗传差异。结论山东产丹参具有一定的遗传多样性，AFLP技术可用于丹参道地性鉴别。
       关键词：山东产丹参；  遗传多样性；  扩增片段长度多态性技术
       AFLP Fingerprint Analysis of Salvia miltiorrhiza from Shandong
       HAO Gang-ping, SUN Li-yan, SHI Ren-jiu, GAO Yun-sheng, WANG Jian-mei
       (Department of Biological Science, Taishan Medical College, Taian, Shandong 271016 China)
       Abstract：ObjectiveTo study the genetic diversity of Salvia miltiorrhiza in Shandong and the application of amplified fragment length polymorphism (AFLP) to the identification of natural herb. MethodsThe polymorphisms of 15 Salvia miltiorrhiza specimens from Shandong were detected by AFLP technology. ResultsThe DNA fingerprint of 15 Salvia miltiorrhiza specimens were generated by four primer combinations. The result indicated that similarity of Salvia miltiorrhiza and white flower Salvia miltiorrhiza was low and two clusters were generated by these two species respectively. This result showed that the consanguinity of Salvia miltiorrhiza was distant to the white flower Salvia miltiorrhiza. Salvia miltiorrhiza from Linyi were clustered into one big group, and   there was genetic diversitybetweenwild and cultivated Salvia miltiorrhiz. ConclusionGenetic diversity exists between Salvia miltiorrhiza from Shandong and AFLP technology has provided us the method of study on genuineness of Salvia miltiorrhiza.
       Key words：Saliva miltiorrhiza from Shandong;  Genetic diversity;  AFLP
   
　　扩增片段长度多态性技术（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一种20世纪90年代发展起来的DNA分子标记技术，具有RFLP的稳定性和RAPD的简便快捷性。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。因此AFLP技术不仅广泛用于植物、微生物的遗传多样性研究，而且在生物的基因作图、基因定位、连锁分析及亲缘关系鉴定等方面也有广泛的应用［1］。罗志勇等［2］首次用AFLP技术构建了人参Panax ginseng.C.A.Mey.和西洋参Panaxquinquefolium. L.的DNA指纹图谱，具有丰富的多态性。这对于鉴别人参品种、真假人参等提供了非常有效的工具。虞泓等［3］应用AFLP技术分析石斛属4种植物的亲缘关系，说明AFLP技术可用于药用石斛DNA指纹图谱研究。丹参Salvia miltiorrhiza是我国传统中药, 具有活血化淤、通经止痛的功能。现代药理研究表明丹参对心血管系统作用十分显著，已成为治疗冠心病最常用的中药之一。丹参的生态适应性强，在我国广泛分布于华北、华东、中南西北、西南部分省区也有分布。随着野生资源的减少，20世纪70年代中期丹参已经供不应求，在全国许多地区都开始栽培，目前栽培品已成为丹参的主要来源。黄秀兰等［4］对不同产地的丹参所含有效成分丹参酮ⅡA进行了测定，实验结果表明山东产的丹参丹参酮ⅡA的含量最高，属于丹参的道地产区。目前，国产栽培丹参长期采用无性繁殖，品种混杂，严重退化，商品质量和产量极不稳定，已成为国产丹参出口创汇和生产质量管理规范(GAP)研究的“瓶颈”。因此开展科学的丹参资源鉴定研究对于丹参的临床药用及中药现代化事业的发展具有重大意义。郭宝林等［5］利用RAPD方法对丹参主要居群的遗传关系及药材道地性进行了初步研究，结果显示，丹参居群内遗传多样性十分丰富，山东和河南产的丹参可以认为是丹参的道地药材。目前国内外还没有采用其它分子标记技术研究丹参居群与道地性的报道，尤其在山东丹参种质资源的分子鉴定研究方面更是空白。为了寻找鉴定丹参类药材和山东产药材的道地性的新方法，本研究采用AFLP技术对山东产丹参进行了基因组DNA多态性分析，并结合聚类分析探讨了供试类群的亲缘关系，说明AFLP技术可用于山东产丹参的DNA分子指纹图谱构建，为进一步研究山东丹参的道地性，合理利用和保护山东丹参属药用资源奠定基础。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料所用植物材料为2005年在山东丹参的主要产区采集的叶片，由泰山医学院苏延友教授鉴定。具体见表1。
       表1  用于AFLP分析用的丹参（略）
       1.2  方法
       1.2.1  DNA提取选用的不同产地的丹参叶片，提取DNA。具体方法见文献［6］。
       1.2.2  AFLP分析体系的建立总体积为25 μl，其中包括样品DNA(50 ng/μl) 5 μl，EcoRI/MseI(1U/μl) 2 μl，5× Reaction Buffer 5 μl，加水至25 μl，37℃保温5~7 h。然后70℃水浴15 min使酶失活。取10 μl在1%琼脂糖上检测。酶切后每个DNA样品，加入14.6 μl连接混合液，其中包括ligation solution 14 μl,T4DNAligase(1U/μl) 0.6 μl ,20℃连接过夜。取3 μl连接完成的DNA样品，加入17 μl如下混合液：10×PCR Buffer 2 μl,  MgCl2(25 mol/L)  1.2 μl,  dNTP  (2.5 mol/L) 1.6 μl,  Taq酶 (3U/μl) 0.3 μl,  EcoRⅠ00 (50 ng/μl) 0.6 μl,  MseⅠ00 (50 ng/μl) 0.6 μl, ddH2O 10.7 μl混匀后在9700型PCR仪上按如下PCR条件扩增。94℃ 2 min， 94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共25个循环，72℃ 5 min。预扩增反应完成后，取5 μl预扩增产物和1 μl Loading Buffer混匀后，在1％琼脂糖凝胶电泳中检测预扩增的效果，然后将剩余15 μl预扩产物中加入285 μl 0.1×TE混匀后-20℃保存。取5 μl稀释的预扩增混合液，加入15 μl如下反应液，10×PCR Buffer 2 μl, MgCl2(25 mol/L)1.2 μl, dNTP(2.5 mol/L)1.6 μl, Tag酶(3u/ul) 0.3 μl, EcoRI(50 ng/μl) 0.8 μl, MseⅠ(50 ng/μl) 0.8 μl, dd H2O 8.3 μl混匀后，按如下PCR程序扩增。94℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s（每循环1次温度下降0.7℃），72℃ 1 min，共11个循环。94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共22个循环，72℃ 5 min，4℃ +∞。扩增后的样品中加入10 μl Loading Buffer混合液混匀后，经95℃变性6 min，立刻转移到冰浴中冷却，待用。
       1.2.3  电泳成像取5 μl PCR扩增产物，在6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上80 W （2 000 v）恒功率电泳约2.5 h。银染显色，图像扫描仪扫描成像。
       1.2.4  数据处理和分析根据15个山东产丹参种质资源基因组DNA的AFLP标记检测结果，选取清晰可辨的多态谱带用于数据统计分析。有带的记为1，无带的记为0，得到原始数据矩阵。利用NTSYS软件计算相似系数，并用NTSYS软件中的UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)法进行聚类分析，构建聚类图。
       　　2  结果
       2.1  丹参的AFLP指纹图与遗传多样性本研究选用4对引物组合实验，每对引物组合扩增结果在不同的材料间表现出了丰富的多态性(图1)，就清晰、可分辨的AFLP条带数来说，每组引物最多的达113条，最少的为49条，平均每对引物组合扩增带数为74.3条，分子量在50~800bp之间，但每对引物组合在不同的材料间也出现了一些共同的带，最多达22条，最少的3条，这充分说明了各材料之间遗传背景的复杂性及共同性。4对引物组合共扩增出DNA片段341个，其中多态性位点243个，多态性位点比例达到71.26%。图1为4对引物组合的扩增产物电泳图（图1）。4对引物组合在检测多态性能力方面略有不同（表2），E-AAC/ M-CCT产生多态位点74（78.723%），E-ACT/ M-CCG产生多态位点63（69.23%），E-AAG/ M-CCC产生多态位点59（76.623%），E-ACC/ M-CAT产生多态位点47（59.494%）。不同的居群多态位点从41(32. 8%)到69(55. 2%)不等。
       表2  4组引物组合产生的条带总数、多态条带数及多态条带百分比（略）
       1-15 E-AAC/ M-CCT; 15-30 E-ACT/ M-CCG;30-45 E-AAG/ M-CCC; 45-60 E-ACC/ M-CAT
       图1  AFLP分析电泳图（略）
       2.2  遗传相似性分析根据4对AFLP引物组合的检测结果计算15个山东产丹参种质资源的遗传相似系数(表3)，结果显示，最高相似系数为0.7143，说明山东产丹参种质资源之间具有一定的遗传差异。其中3个白花丹参具有较高的相似性，采于济南和莱芜的两个栽培种之间相似性最高，与采于泰山的野生白花丹参之间显示一定的遗传差异，相似系数为0.678 7，而白花丹参和丹参之间的相似系数较小。采于蒙山和沂南野生品种之间也具有很高的相似性，相似系数也为0.714 3。采于胶南和沂水两个地区的栽培丹参之间具有最低的相似性，系数为0.285 7。
       2.3  聚类分析根据遗传相似系数，通过UPGMA法构建了15个山东不同产地丹参的的分子聚类图（图2）。从聚类图中可以看到，当相似系数为0.48左右时，15份丹参样品聚为两大类。第1大类是白花丹参，其中莱芜和临沂的栽培白花丹参聚合在一起，差异很小，与泰山野生白花丹参分开。第2大类是栽培和野生丹参样本，在0.53处又有两个分支，第1分支主要包括临沂地区的野生和栽培样本（1~3，6，7，9）。第2分支样本来源地区比较广泛，包括来源于博山和临朐栽培样本（4，11），这两个样本聚在一起；来源于沂南和胶南的栽培样本（10，12），这两个样本也聚在一起。来源于荷泽栽培8号样本和来源于济南千佛山的野生丹参5号样本单独分支。从整个聚类图可看出，两大分支分化十分显著，将丹参和白花丹参样本区别开来，说明这两个品种之间遗传多样性丰富。
       表3  山东产15个丹参居群的相似系数（略）
       图2  丹参样品的UPGMA聚类图（略）
       　3  讨论
       由于样本来源的限制，本研究涉及的样本个体较少，尚不能完全反映山东产丹参的遗传关系，但本研究可以得出一些基本结论。本研究采用了15份山东产的丹参样本进行AFLP分析，结果显示，AFLP分析结果与其形态学分类基本相一致［7］。从遗传相似系数和聚类关系图看，丹参和白花丹参样本的遗传相似性较低，聚类结果也划分为两大类群，证明它们之间的亲缘关系较远，分化比较明显，说明AFLP分析方法具准确性。在聚类图的丹参样本聚类居群内，临沂地区来源的丹参样本单独聚为一类，这一居群内部既有野生样本，也有栽培样本，但采于蒙山和沂南野生品种之间的相似性很高，与当地的栽培品种有一定的差异，说明这一地区的人工栽培影响到丹参的遗传特性。栽培品种和野生品种之间具有一定的遗传差异，这与郭宝林等［5］的研究结果一致。由于山东不同产地的丹参在形态学上难区分，出现品种混杂，但 AFLP 能检测出同一地区不同居群之间的遗传差异，表明这种技术能区分出遗传差异极小的样本，周春玲等［8］对龙须草的研究也得出同样的结果。从以上结果可以看出，应用AFLP技术对山东产丹参品种的鉴定及彼此亲缘关系的分析具有快速、准确和可信度高的特点，可进一步用于丹参中药材的道地性分析。由于本研究的取样地区和采样量尚很不足，结果只能说明AFLP技术应用于丹参遗传多样性分析的可行性，进一步的丹参道地性研究正在进行中。
       　　参考文献：
       ［1］  白史且,高荣, 沈翼,等.假俭草遗传多样性的AFLP指纹分析［J］. 高技术通讯，2002， 10：45.
       ［2］  罗志勇,周  钢,周肆清,等.AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱［J］.药学学报,2000,35(8):626.
       ［3］  虞  泓,和  锐,倪念春,等. 石斛属4种植物的AFLP分析［J］.中草药,2004,35(7):808.
       ［4］  黄秀兰,王长根,董月丽. 野生和栽培丹参的质量研究［J］.中药材, 1989, 12 (6): 31.
       ［5］  郭宝林, 林  生, 冯毓秀,等. 丹参主要居群的遗传关系及药材道地性的初步研究［J］.中草药,2002,33(12):1113.
       ［6］  郝岗平, 边高鹏, 张媛英.泰山白花丹参干叶片高质量DNA提取 ［J］.中草药,2006,37(6):855.
       ［7］  李建秀,孙秀霞,周凤琴,等. 山东丹参类药用植物新资源［J］. 山东中医学院学报,1995,19(3):190.
       ［8］  周春玲，戴思兰.菊属部分植物的AFLP分析［J］.北京林业大学学报,2002, 24（5-6）：71.
       基金项目：山东省中医药管理局资助项目（No.2005234）
       (泰山医学院，山东 泰安  271016)