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       【关键词】  外燥；,,bcl-2基因；,,bax基因；,,细胞凋亡
       摘要：目的观察外燥对小鼠气管细胞凋亡与bcl-2基因及bax基因表达的影响。方法30只昆明种小鼠随机分为常温常湿组（A组），温燥组（B组），凉燥组（C 组），每组10只。经处理后第14天用免疫组化法检测各组气管细胞凋亡率（%）、bcl-2、bax阳性指数（PI，%）、bcl-2/bax累积阳性指数（AI，%）与bcl-2:bax蛋白表达比值。结果3组小鼠气管细胞凋亡率均≤0.3%；B组与C组 bcl-2 PI与AI均低于A组（P<0.01)，B组、C组气管细胞bcl-2:bax蛋白比值中bax增加。结论外燥致气管细胞bcl-2表达降低、bcl-2:bax蛋白比值改变，bcl-2、bax 阳性细胞以气道炎性病灶或纤毛缺损处多见,提示与外燥分子致病机制有关。
       关键词：外燥；  bcl-2基因；  bax基因；  细胞凋亡
       Effects on Apoptosis and Expression of Bcl-2 and Bax Gene in Respiratory Intraepithelium of Mice with Outer-Dry
       DING Jianzhong, GONG Quan*, CHEN Gang, LI Junchuan, CHEN Tingxuan, LI Kan
       (Medical School of Yangtze University, Jingzhou,Hubei 434000, China; Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan, Hubei 430061, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate apoptosis and expression of bcl-2 gene,bax gene in respiratory intraepithelium of mice with outer-dry.Methods30 kunming mice were divided into three groups, including group A(normal mice),group B(warm-dry mice),group C(cool-dry mice)，10 mice/group. Expression of bcl-2 gene,bax gene and apoptosis were measured on the 14th day.ResultsThere was no significant difference for apoptosis among the three groups. Bcl-2 PI and AI  in group B and C were markedly reduced compared with group A(P<0.01),and bax gene increased in the ratio of bcl-2:bax protein.ConclusionOuter-dry can decrease the expression of bcl-2 gene, change the ratio of bcl-2:bax protein.
       Key words：Outer-Dry;  Bcl-2 gene;  Bax gene;  Apoptosis
   
　　细胞凋亡是细胞接受某种信号后的一种由基因控制维持组织细胞动力学平衡的生理性死亡过程。bcl-2基因、bax基因在疾病机制研究中倍受关注，细胞增殖与凋亡平衡的实质可能是中医阴阳在细胞水平上的表现［1］，分子生物学理论与技术成为探析中医病因病机的新方法之一 。近年来从气象因素、生物致病因子和机体反应性等研究六淫中风、寒、湿、火（热）等病邪,有的已达分子水平［2］，但对燥邪病因病机研究较为滞后。课题组的相关研究结果显示，外燥致小鼠气道分泌功能障碍、气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润等病变。本文研究外燥对小鼠气管细胞凋亡与bcl-2基因、bax基因表达的影响，为外燥分子致病机制积累资料。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物 昆明种小鼠（SPF级）30只，体重(18±1) g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。
       1.2  仪器与试剂 人工智能气候箱（LRH-250，温度：(30~65±1)℃，相对湿度：(30%~90%)±5%，广东医疗器械厂，LG风扇程控仪（MASTER-K30H,韩国），光学显微镜（Laica,德国），图像分析系统（HPISA-1000,华中科技大学同济医学院提供）。TUNEL试剂盒（编号：MK1020）、bcl-2羊抗鼠IgG多抗（编号：BA0412，2005-03）、bax羊抗鼠IgG多抗（BA0315，2005-03）、二氨基联苯胺（ED1022，2005-03）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（SA1022，2005-03）、以及各阳性对照片购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.3  方法
       1.3.1  分组与造模30只昆明种小鼠随机分为3组，即常温常湿组、温燥组与凉燥组，每组10只，置人工气候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养，按表1模拟外燥“温度－相对湿度－风”综合条件刺激进行造模。
       1.3.2  气管细胞凋亡检测用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）［3］。各组小鼠在实验前4 h禁食、禁水。主要步骤：第14天断颈处死小鼠，从喉头至气管分叉处剪取气管，标本经100 g/L中性甲醛固定，常规脱水包埋，4 μm厚连续切片；3%H2O2甲醇37℃阻断10 min，0.1 mol/L pH 6.0柠檬酸缓冲液微波加热至95℃，加核苷酸/核苷酸转移酶混合液37℃，1 h，转换POD 37℃，30 min，DAB显色，苏木素复染。结果判断：光镜观察气管上皮细胞核内之棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性。高倍镜下随机计数200个细胞，计算：细胞凋亡率(%) = 凋亡细胞数/200×100%
       表1  各组小鼠“温度－相对湿度－风”处理条件（略）
       1.3.3  气管细胞bcl-2基因、bax基因表达检测标本处理同1.3.2。第14天取各组气管经免疫组化法（链酶亲合素-生物素复合物，微波修饰）检测［4］。主要步骤：标本经5%非免疫羊血清封闭后，按免疫组化染色试剂盒说明书进行操作。设磷酸盐缓冲液空白对照和正常兔血清（1∶50）替代（一抗）对照。结果判断：光镜下见气管上皮细胞浆内之棕黄色颗粒为bcl-2（bax）基因表达阳性。高倍镜下计数500个细胞，按下式计算：阳性指数（PI）=（阳性细胞/记数细胞）х100%bcl-2/bax累积阳性指数（AI）=（bcl-2阳性细胞+bax阳性细胞数/1000个记数细胞）×100%bcl-2:bax蛋白比值=bax PI/(bcl-2 PI+bax PI)
       1.3.4  统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS13.0软件，资料之间比较用ANOVA分析，显着性检验采用多个样本均数间q检验（Newman-Keuls法），P<0.05为差异有统计学意义，检验水准为双侧a=0.05。
       　　2  结果
       外燥对气管细胞凋亡与bcl-2基因、bax基因表达的影响见表2。镜下见三组小鼠气管上皮细胞凋亡率很低（0.15%~0.30%），各组间bax阳性指数差异无显著性（P>0.05）。温燥组第14天bcl-2（bax）阳性细胞多分布于气管纤毛片状缺损处，凉燥组bcl-2（bax）阳性细胞则多为点状分布。温燥组与凉燥组bcl-2阳性指数、bcl-2/bax累计阳性指数低于常温常湿组。温燥组与凉燥组气管细胞bcl-2:bax蛋白比值中bax升高。温燥组、凉燥组气道黏液腺中bcl-2，bax阳性细胞30%，而常温常湿组≤2%（P<0.01）。
       表2  外燥对小鼠气管上皮细胞bcl-2基因、bax基因表达与细胞凋亡的影响（略）
       与常温常湿组比较，*P<0.05, **P<0.01
       　　3  讨论
       bcl-2属于低丰度表达基因，仅在增生活跃的细胞中明显转录，编码的bcl-2蛋白是一种膜结合蛋白，定位于线粒体、内质网及核膜上，通过抑制细胞内质网中钙离子释放、调节抗氧化途径、直接或间接与细胞信号传递蛋白（如p53蛋白）作用等调节细胞生长［5］。bcl-2，bax家族的蛋白-蛋白相互作用，对决定一个细胞是否进入凋亡途径至关重要。根据气象学中“候平均气温”“季平均温度”，课题组以表1条件研究显示，外燥致小鼠气管上皮鳞状化生、中性粒细胞浸润等病变，是开展本实验研究的基础。结果显示，小鼠气道4 μm完整切片（一圈）的假复层纤毛柱状上皮细胞数为550~800个，计数气管上皮细胞数有利于对细胞凋亡与bcl-2基因、bax基因表达阳性细胞的定量检测。各组小鼠气管细胞凋亡数极少，且三组间bax阳性指数差异无统计学意义。温燥组、凉燥组bcl-2阳性指数、bcl-2/bax累积阳性指数低于常温常湿组。值得注意的是，常温常湿组bcl-2∶bax阳性表达比值几近相等（1.00∶0.82），同期组织学观察见其气管上皮排列整齐、纤毛完整；温燥组bcl-2∶bax比值（1.00∶1.94）与凉燥组比值（1.00∶2.70）则是bax增加，温燥组bcl-2、bax阳性细胞多在气管上皮纤毛缺损或鳞状上皮化生处分布，凉燥组bcl-2、bax阳性细胞则以散在分布为主。因为bcl-2/bax蛋白二聚体为抑制细胞凋亡之构型，bax/bax蛋白二聚体可诱导细胞凋亡，本结果提示气管细胞bcl-2表达降低、bcl-2∶bax蛋白比值改变与外燥致气管细胞病理改变有关。结果显示三组小鼠气管细胞凋亡数极少（≤0.3%），是否提示气管细胞凋亡的快速动力学或免疫细胞（巨噬细胞等）对局部凋亡细胞的及时清除。该实验结果也提示，应谨慎对待免疫化染色方法观察小鼠气管细胞凋亡以及对结果的解释。
       　　参考文献：
       ［1］  李秀荣，张丹，齐元富，等.消瘤平移合剂含药血清诱导肝癌H-7402细胞凋亡的实验研究［J］.2001，21（9）：684.
       ［2］  张六通，梅家俊，黄志红，等.外湿致病机理的实验研究［J］.中医杂志，1999，40（8）：496.
       ［3］  石玉枝，柳英兰，霍建明，等.三氧化砷诱导小细胞肺癌细胞凋亡及p53、bcl-2基因表达的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，11（25）：665.
       ［4］  魏  卫，陈菊荣，金河凤，等.非小细胞肺癌中bcl-2及bax蛋白表达与细胞凋亡指数的测定［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，11（25）：665.
       ［5］  Hockenbery DM,Ohvat ZN,Yin XM,et al.bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis［J］.Cell,1993,75:241.
       基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（No.2004ABA185）
       （长江大学医学院，湖北 荆州  434000；  湖北中医学院，湖北 武汉  430061）