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       【关键词】  淫羊藿；,,提取；,,总黄酮；,,正交设计
       摘要：目的研究淫羊藿总黄酮的提取工艺及产地不同的淫羊藿植株总黄酮在各部位的含量分布。方法用乙醇和水回流提取淫羊藿总黄酮；选取湖北恩施及福建三明淫羊藿为原料，做单因素实验，再以淫羊藿总黄酮提取率为考察指标，作正交实验设计；采用紫外分光光度法测定淫羊藿总黄酮含量。结果以乙醇和水作为提取剂的提取率分别为70.5％、31.1％；恩施与三明所产的箭叶淫羊藿其淫羊藿总黄酮含量分别为：叶3.24％，1.02％；茎0.91％，0.14％；根2.47％，0.61％。结论湖北恩施所产的箭叶淫羊藿比福建三明所产的箭叶淫羊藿中总黄酮含量高；乙醇作提取剂的提取率明显高于水，影响淫羊藿总黄酮提取效果的主次因素为：溶剂浓度＞回流时间＞提取次数＞液固比。淫羊藿总黄酮的优化提取工艺为：液固比为12∶1，以60%乙醇提取3次，1.5 h/次，优化工艺的总黄酮提取率达77.5％。
       关键词：淫羊藿；  提取；  总黄酮；  正交设计
       The Extraction Technology for Total Flavone and its Content Distribution in Herba Epimedium
       LIU Min, ZHOU Fang, HUANG Shaowei, CHI Ruan*, WU Yuanxin, WANG Cunwen, JU Xiulian, GUO Jia, HUANG Qimao
       (Hubei Key Lab of Novel Reactor &Green Chemical Technology, Wuhan Universiby of Engineering, Wuhan, 430073，China, ) 
       Abstract：ObjectiveTo study an extraction Technology for total flavone and to determine the content distribution in Herba Epimedium. MethodsThe extraction rate was compared between ethanol extract and water extract. The optimum extractive conditions were investigated by orthogonal design and one-factor experiment. ResultsThe extraction rates with ethanol and water as extractants were 65.2%, 26.6%, respectively. The contents of Epimedium flavonoids from Enshi in root, stalk and leaf were 3.24％，0.91％ and 2.43％，respectively, while the ones from Sanming were 1.02％, 0.14％, 0.61％, respectively. ConclusionThe factors which influence extraction rate are sorted as follows: A＞C＞D＞B, where A, B, C and D stands for the concentration of ethanol, the dosage of ethanol, extract time and times of leaching, respectively. The optimum technology of extraction is as follows: 60% ethanol, twelve-fold leachant, 3 times extraction and 1.5 hours. The extraction rate is up to 77.5%.
       Key words：Epimedium；  Extraction；  Flavonoid；  Orthogonal design
   
　　淫羊藿Herba Epimdium为小檗科淫羊藿属植物，具有温心阳、通心脉、化淤血等功效［1］，其中主要有效成分是淫羊藿总黄酮（包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷等），现代研究认为该总黄酮具有促进雄性激素分泌、降血压、扩张血管、增加冠脉流量、增强免疫功能和抗肿瘤等多种药理作用［2］。湖北恩施和福建三明地区淫羊藿资源丰富，但未见以该地区淫羊藿为原料的提取及测定方法研究，且文献［3，4］多报道淫羊藿叶中有效成分（以淫羊藿总黄酮计）含量最高，茎其次，根中最低，因此大多数提取工艺只采用淫羊藿地上部分（包括叶和茎）作为原材料，导致大量的根被丢弃，造成了巨大的资源浪费。本文从资源有效利用的角度出发，比较了恩施及三明地区所产箭叶淫羊藿的叶、茎、根中淫羊藿总黄酮的含量，并比较了醇提与水提的提取率，同时采用正交设计实验优化了醇提工艺。
       　1  仪器与材料
       1.1   仪器UVVIS 8500 紫外/可见分光光度计，电子分析天平 (AL204)，数显无级恒速搅拌器，SHZD（III）循环水式真空泵。
       1.2   材料淫羊藿，购自湖北恩施和福建三明，经湖北中药研究院王克勤研究员鉴定为箭叶淫羊藿；淫羊藿苷对照品,批号110737200312，中国药品生物制品检定所提供；甲醇（分析纯），乙醇（工业纯），双蒸水（自制）。
       　　2  方法
       2.1   分析方法
       2.1.1  标准曲线的绘制称取淫羊藿苷对照品15.2 mg，用甲醇溶解于250 ml容量瓶中，配制成60.8 μg/ml对照品溶液。分别移取对照品溶液0.0 ，0.5 ，1.0，1.5 ，2.5，3.5，4.5 ml置于10 ml容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀。对浓度为15.2 μg/ml的对照品溶液进行全波长扫描，测得270 nm处有最大吸收，因此于270 nm下测定上述各标准液的吸光度。以浓度（C）与吸光度（A）进行线性回归，得回归方程为A＝0.037 3C0.001 8，r＝0.999 9，在0～27.45 μg/ml范围内呈线性关系［5～7］。
       2.1.2   样品溶液的制备取粗提物25 mg于50 ml容量瓶中，加入甲醇约40 ml，超声使溶解充分，定容至刻度；取部分溶液离心，准确吸取离心后的溶液1 ml至10 ml容量瓶中，用甲醇稀释，定容，作为样品溶液备用。
       2.1.3   重复性实验将同一样品溶液连续测定其吸光度（A）6次，计算相对标准偏差为0.096％，重复性良好。
       2.1.4   加样回收率实验分别吸取已知含量的样品溶液1  ml（10份）至0＃～9＃ 10个25 ml容量瓶中，分别加入1 ml对照品溶液，以甲醇溶解并定容，测定吸光度，计算0＃～9＃样品回收率。各样品回收率均在98.6％～101.7％之间，平均回收率100.2％，相对标准偏差为0.99％，精确度良好。
       2.2  提取方法
       2.2.1   索氏回流提取湖北恩施、福建三明地区箭叶淫羊藿叶、茎、根中总黄酮分别取50 g淫羊藿植株的叶、茎和根的粗粉（200目）于索氏提取器中，用乙醇回流提取，直至提取液无颜色为止，提取液过滤，减压浓缩，干燥至恒重。后续实验均以恩施淫羊藿为原料。
       2.2.2  提取工艺
       2.2.3   单因素实验分别考察温度、溶剂种类、溶剂用量及时间对提取率的影响。
       2.2.4  醇提工艺的正交设计根据单因素实验，结合文献［8］报道，作 L9（34）正交设计［9］，因素水平表见表1。
       表1  正交设计因素水平表（略）
       　　3  结果
       3.1  淫羊藿植株不同部位总黄酮含量分布由于研究淫羊藿不同部位的有效成分含量对指导工业提取和农业栽培都具有重要意义，测定了淫羊藿植株不同部位总黄酮含量，其分布见表2所示。
       表2  湖北恩施与福建三明地区箭叶淫羊藿不同部位的有效成分含量及质量分数（略）
       由上述结果可知，淫羊藿叶的提取量最大，但提取的杂质也较多，造成提取物中有效成分含量较低；根的提取量较小，但有效成分含量很高；茎的提取量最小，有效成分含量也最低。从表中数据发现，恩施淫羊藿叶、根、茎中总黄酮含量均高于三明淫羊藿；两地淫羊藿植株各部位的淫羊藿总黄酮含量均为叶＞根＞茎，且淫羊藿植株的不同部位的质量比重分别为：24.9％，48.9％，26.2％（恩施），25.2％，24.7％，50.1％（三明）。本实验得出湖北地区与福建三明地区所产淫羊藿不同部位淫羊藿总黄酮含量均为叶＞根＞茎，这与部分文献［4，5］的结果不一致，可能是原料的产地不同或采收的时期不一样所致。
       3.2   提取条件的选择
       3.2.1  溶剂对提取率的影响分别采用60％乙醇和水作为提取剂，重复提取3次。测定提取物中总黄酮含量，并以索氏回流的提取率为100％为参比，计算淫羊藿总黄酮提取率。结果见表3。
       表3   水与醇作提取剂时提取率比较（略）
       由表3可以看出，用60％乙醇作溶剂提取淫羊藿总黄酮的提取率明显高于以水作溶剂时的提取率。
       3.2.2  温度对提取率的影响 取5份10 g淫羊藿粗粉于250 ml三口烧瓶中，分别在60，70，80，90，100 ℃恒温水浴锅中回流提取60 min，过滤测吸光度，计算淫羊藿总黄酮提取率。结果见表4。由表4实验数据可知，提取淫羊藿总黄酮的最佳温度为80℃。故后续实验均在80℃水浴中进行。
       3.2.3  乙醇浓度对提取效果的影响分别取6份各10 g干燥的淫羊藿粗粉于6个250 ml烧瓶中，加入20％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各120 ml，80℃水浴回流60 min，过滤，测吸光度，计算淫羊藿总黄酮提取率。结果见表5。
       表4  提取温度对提取率的影响（略）
       表5  乙醇浓度对提取率的影响（略）
       表5中数据显示，同样温度、同样提取时间、液固质量比为12∶1，60％乙醇提取率最好。
       3.2.4  液固比对提取率的影响  分别取7份10 g干燥淫羊藿粗粉于7个250 ml烧瓶中，分别加入淫羊藿粗粉重的6，8，10，12，16，20倍的60％乙醇，80℃水浴回流60 min，过滤，提取液均用60％乙醇稀释至同一体积，测吸光度，计算淫羊藿总黄酮提取率。结果见表6。
       表6  液固比对提取率的影响（略）
       由表6实验数据可以看出，液固比对淫羊藿总黄酮的提取率影响不大，故而选取的溶剂量只需将原料粗粉完全浸没即可。
       3.2.5   提取时间对提取率的影响取20 g干燥淫羊藿粗粉于500 ml三口烧瓶中，加入240 ml 60％乙醇，分别在回流20，40，60，90，150，180，240，300 min时取样测定其吸光度，计算淫羊藿总黄酮提取率。结果见图1。
       图1  提取时间对提取率的影响（略）
       由图1可知，回流提取1.5 h后，溶液中淫羊藿总黄酮提取率趋于平衡。
       3.3   正交实验设计总黄酮提取结果根据以上单因素实验的结果，选择L9 (34)表，实验方案及计算结果见表7。由正交实验的结果可知，淫羊藿总黄酮含量最高的提取工艺为 A2B1C2D3，即60％乙醇，液固比为8∶1，回流90 min，提取3次；但由极差分析可知，优化提取工艺为 A2B3C2D3,即60％乙醇，液固比为12∶1，回流90 min，提取3次。影响总黄酮提取的主次因素为：A＞C＞D＞B，即乙醇浓度>回流时间＞提取次数＞液固比。
       表7  L9 (34)正交实验结果（略）
       按照极差分析得出的优化提取工艺进行了3批原料的平行提取，提取率分别为77.1％，77.6％，77.8％，平均提取率为77.5％，高于正交实验中按 A2B1C2D3工艺所得的最高提取率77.0％。由极差分析的结果表明，固液比对于淫羊藿总黄酮的提取影响很小，故而从生产成本考虑，液固比可适当减小。
       　　4  结论
       淫羊藿总黄酮为淫羊藿中主要有效成分，用紫外分光光度法测定淫羊藿总黄酮含量，方法简单，易操作，技术成熟，重现性好。湖北恩施和福建三明所产的箭叶淫羊藿植株中根约占整个植株的50%（48.9％/50.1%），且根中有效成分的含量也较高（2.43％/0.61%），因而工业生产中可以有效利用淫羊藿根部资源，一方面增加提取率，另一方面也减少资源浪费。乙醇提取率较水提好，溶出杂质少，有利于后续分离，溶剂可回收，适于工业生产；优化的提取工艺为60%乙醇, 液固比为12∶1,回流90 min,提取3次。
       参考文献：
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       基金项目：湖北省科自然科学基金创新群体资助项目（No.2006ABC014）
       (武汉工程大学・湖北省新型反应器与绿色化学工艺重点实验室，湖北 武汉  430073)