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       【关键词】  天年饮；,,衰老；,,生精细胞；,,凋亡；,,睾酮；,,p53基因
       摘要：目的研究中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响。方法40只SD大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组及阴性对照组，每组均为10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。采用ELISA方法检测各组大鼠血清睾酮含量、SP免疫组化法检测睾丸生精细胞p53蛋白的表达情况、TUNEL法检测各组大鼠睾丸生精细胞的凋亡情况。结果衰老大鼠血清睾酮含量明显降低（模型组与正常组比较：P<0.05），衰老大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数明显高于正常大鼠（P<0.01）。天年饮用药组大鼠血清睾酮含量较衰老大鼠明显升高（P<0.05），天年饮用药组大鼠睾丸p53阳性细胞率及凋亡指数较衰老大鼠明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论中药天年饮可改善衰老大鼠的生精功能，具有一定延缓衰老的作用。
       关键词：天年饮；  衰老；  生精细胞；  凋亡；  睾酮；  p53基因
       Effects of Traditional Chinese Medicine Tiannianyin on Apoptosis and Related Factors of Spermatogenic Cells in Testis of Aging Rats
       DU Jinkai，LI Yan，CHEN Zhihong，XUE Jingfeng*
       (Basic Medical Institute of Chengde Medical College，Chende, Hebei 067000,China; Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 076000, China)
       Abstract：Objective To observe the effects of traditional Chinese medicine Tiannianyin on apoptosis and related factors of spermatogenic cells in testis of aging rats. Methods40 SD rats were applied in this study and divided into 4 groups at random: normal group, aging model group, Tiannianyin group, negative control group, and each group had 10 rats. The sub-acutely aging model rats were made by injecting D-gal into abdominal cavity continuously. ELISA was used to detect the testosterone content in serum, SP immunohistochemistry to observe the p53 expression and TUNEL to detect apoptosis of spermatogenic cells in testis. ResultsThe testosterone content in serum of aging rats decreased significantly compared with normal rats (P<0.05); the p53 positive cells and apoptotic index of aging rats were much higher than those in normal rats (P<0.01). Tiannianyin could inhibit the decrease of testosterone content in serum significantly (Tiannianyin group compared with aging model group: P<0.05), and decrease the p53 expression and apoptotic index significantly(P<0.05, P<0.01). ConclusionTraditional Chinese medicine Tiannianyin can improve the spermatogenic function of aging rats, and has fairly anti-aging effects.
       Key words：Tiannianyin;   Aging;  Spermatogenic cell;  Apoptosis;  Testosterone;  p53 gene
   
　　抗衰老是一个古老的话题，目前国内、外应用的抗衰老方法有很多。中药延缓衰老作用的研究已逐渐深入，在细胞传代、寿命实验、免疫内分泌代谢等领域进行了多方面的研究，揭示了不少药物的抗衰老机理，但各自研究的方面不同。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝等组成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型，观察天年饮对睾丸生精细胞凋亡及相关因素的影响，探讨天年饮延缓衰老的作用机制。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物的选择及分组  成年雄性SD大鼠40只，体重180~250 g（由河北医科大学实验动物中心提供，合格证书：医动字第04057号）。将大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组，每组10只。其中模型组、用药组、阴性对照组均采用D-半乳糖连续腹腔注射（按200 mg・kg1-・d-1给药，1次/d，连续40 d）制作亚急性衰老大鼠模型。模型组大鼠造模成功后不再做任何处理；用药组大鼠造模成功后每天用天年饮灌胃，共30 d；阴性对照组大鼠在造模成功后灌胃同等剂量的生理盐水，时间同用药组大鼠。
       1.2  药品与试剂  D-半乳糖(D-gal)由北京化学试剂公司生产(批号020402)。天年饮由炙何首乌、怀牛膝、肉从蓉、淫羊藿、丹参、茯苓等六味中药组成，经熬制后每毫升含生药1.5 g灌胃。检测血清睾酮含量的ELISA试剂盒及免疫组化、凋亡试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
       1.3  指标检测
       1.3.1  血清睾酮含量的检测大鼠经内眦取血，离心取上清，采用ELISA方法检测睾酮含量。
       1.3.2  p53 表达的检测及定量数据处理大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取双侧睾丸，后固定过夜，常规石蜡包埋、切片，片厚5 μm，按试剂盒说明以SP免疫组化法检测p53的表达情况，一抗为鼠抗p53 1∶100，阴性对照用PBS代替一抗。以细胞核出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。p53阳性反应的切片在显微镜(×400倍)下进行细胞计数，在切片上随机选取阳性细胞分布均匀的区域，每个切片检查10个视野，每个视野数出总细胞数和阳性细胞数，计算出阳性细胞的百分比。每组计数3只动物的睾丸，每个标本计数3张切片。
       1.3.3  凋亡细胞的检测采用脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）介导的原位末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nicked labeling， TUNEL）检测凋亡细胞。以细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。凋亡阳性细胞按Yin［1］的方法进行数据处理：显微镜下任选10个视野，计数生精小管横切面的总数及含凋亡细胞的阳性生精小管数；再计数10个生精小管中的总细胞数和阳性细胞数，计算阳性细胞的百分比。每组计数3只动物的睾丸，每个标本计数3张切片。
       1.4  统计方法  实验数据以 ±s表示，应用SPSS11.5 统计分析软件进行统计处理，以t检验和χ2  检验进行分析。
       2  结果
       2.1  血清睾酮的含量  结果见表1。
       表1  各组大鼠血清睾酮含量和p53阳性细胞率比较（略）
       与正常组比较，*P<0.05；与正常组比较，#P<0.01；与模型组比较，**P<0.05由表1可见，与正常组相比，D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠血清睾酮含量明显降低(P<0. 05)，天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量的下降，用药组与模型组比较差异显著(P<0.05)。
       2.2  TUNEL染色结果  各组大鼠睾丸生精细胞均有凋亡发生，凋亡细胞包括精原细胞和初级精母细胞，阳性细胞核为棕黄色。正常大鼠凋亡细胞单个散在，而模型大鼠凋亡细胞成簇分布（图1~2）。各组大鼠睾丸凋亡管数和凋亡阳性细胞率见表2。
       表2  各组大鼠睾丸凋亡管数和凋亡阳性细胞率比较（略）
       与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，**P<0.01
       由表2可见模型组大鼠凋亡生精细胞数量较多，凋亡管数和凋亡阳性细胞率均明显高于正常组（P<0.01）；用药组大鼠生精细胞凋亡数量较少，凋亡管数和凋亡阳性细胞率与模型组比较有显著差异（P<0.01）, 用药组大鼠睾丸生精细胞的凋亡指数明显低于模型组大鼠。
       图1  正常大鼠凋亡生精细胞 （略）    
       图2  衰老大鼠凋亡生精细胞（略）
        
　　2.3  睾丸生精细胞p53表达的变化p53蛋白阳性细胞主要为精原细胞，偶见支持细胞着色，阳性产物主要位于细胞核，呈棕黄色圆形分布，而阴性对照则未见任何细胞着色（图3~4）。各组p53阳性细胞率见表1。由表1可见，模型大鼠p53阳性细胞率与正常大鼠相比明显升高（P<0.01）；用药组大鼠p53阳性细胞率与模型组大鼠相比明显降低（P<0.05）。
       　　3  讨论
       近年来已有大量文献报道性腺功能衰退与机体衰老密切相关［1，2］。随着年龄增长，睾丸的结构和功能会出现一个由盛到衰的演变过程，出现精子生成能力减弱、血游离睾酮含量下降等变化。早在1889年法国医学家Brown Sequard 就认为睾丸提取液有“延缓衰老”的奇效，并且目前性激素替代疗法仍是治疗许多老年病的主要方法，有研究发现补充睾酮可改善心肌缺血、抑制动脉粥样硬化［3，4］。
       图3  正常大鼠p53的表达（略）     
       图4  衰老大鼠p53的表达（略）
    
　　祖国医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因，《素问・金匮真言论》有记载：“夫精者，身之本也”，并认为“天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极”是衰老的主要原因。肾为先天之本，肾藏精，其精气是构成人体和促进人体生长发育的基本物质。所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。现代研究也表明，何首乌、淫羊藿、丹参、肉苁蓉等具有改善脂肪代谢、改善心脑血管功能、抗氧化等多方面的作用。p53是重要的肿瘤抑制基因，在正常细胞中野生型p53基因参与细胞周期的调控［5］，具有阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组的稳定及抑制肿瘤血管生成等多方面的功能。在睾丸正常生精过程中，p53也起着重要的调控作用，研究发现，在衰老大鼠的睾丸中p53的表达水平是升高的，这些都提示p53可通过调节生精细胞凋亡的发生来调节生精过程［6~8］。研究结果也表明p53参与了生精细胞的凋亡。实验研究发现，天年饮可以提高模型大鼠血清睾酮含量；明显降低衰老大鼠睾丸p53阳性细胞率；降低生精细胞的凋亡指数。说明天年饮可以通过提高血清睾酮含量、降低衰老大鼠p53表达、降低生精细胞的凋亡指数等来改善衰老大鼠的生精功能，起到延缓衰老的作用。
       参考文献：
       ［1］  Yin YZ, Hawkins KL, Dewolf WC, et al. Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice［J］. J Androl, 1997,18(2):159.
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       ［3］  武  强，李小鹰. 雄激素治疗冠心病及其机制［J］.中华老年心脑血管病杂志，2002，3（3）：90.
       ［4］  Katherine M, Rich P, Jones H, et al. Low dose transdermal testosterone therapy improves angina threshold in men with chronic stable angina, a randomized, double-blind, placebo-controlled study［J］. Circulation, 2000,102:1906.
       ［5］  Takeuchi A, Mishina Y, Miyaishi O, et al. Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis［J］. Nat Genet, 2003,33(2):172.
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       ［8］  Beumer TL, Roepers-Gajadien HL, Gademan IS, et al. The role of the tumor suppressor p53 in spermatogenesis［J］. Cell Death Differ, 1998,5(8):669.
       基金项目：河北省承德市科技局资助项目（No.200411032）
       (承德医学院基础医学研究所，河北  承德  067000；承德医学院附属医院，河北 承德  076000)